Inleiding
Kcat is het omzetgetal — het aantal substraatmoleculen dat elke enzymplaats per tijdseenheid omzet in product. Als u de concentratie van enzymplaatsen kent, kunt u kcat in plaats van Vmax passen bij het analyseren van een substraat Versus snelheidscurve.
het model
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X is de substraatconcentratie.
Y is enzymsnelheid.
kcat is het omzetgetal, het aantal keren dat elke enzymplaats substraat omzet in product per tijdseenheid. Dit wordt uitgedrukt in de inverse van de tijdeenheden van de Y-as. Bijvoorbeeld, als Y in micromol van substraat per minuut is, dan is kcat het aantal molecules van substraat dat per katalytische plaats per minuut wordt geproduceerd.
Km is de Michaelis-mentenconstante, in dezelfde eenheden als X. Het is de substraatconcentratie die nodig is om een half-maximale enzymsnelheid te bereiken.
Et is de concentratie van enzymkatalytische plaatsen. Als het enzym meerdere subeenheden heeft, merk op dat Et de concentratie van katalytische plaatsen is, die groter kan zijn dan de concentratie van enzymmolecules. De Y-waarden die u invoert zijn enzymsnelheid ingevoerd in eenheden van concentratie per tijd. Et moet worden ingevuld in dezelfde concentratie-eenheden (terwijl de tijdseenheden worden gedefinieerd door kcat).
Vmax is de maximale enzymsnelheid in dezelfde eenheden als Y. Het wordt niet direct weergegeven in het bovenstaande model. Het is de snelheid van het enzym geëxtrapoleerd naar zeer hoge concentraties van substraat, dus is bijna altijd hoger dan elke snelheid gemeten in uw experiment. Het wordt berekend door ET met kcat te vermenigvuldigen.
relatie met het Michaelis – Menten model
de hierboven getoonde curve is identiek aan de curve gedefinieerd door het Michaelis-Menten model. U krijgt identieke bochten wanneer u een van beide modellen past op uw gegevens, en identieke waarden Voor Km.
Het Michaelis – Menten model vindt de Vmax, de maximale enzymsnelheid geëxtrapoleerd naar zeer hoge concentraties van substraat. Het wordt uitgedrukt in dezelfde eenheden die u gebruikte om uw Y-waarden in te voeren (enzymactiviteit). Meestal is het eenvoudig om dit uit te drukken (of om te zetten in ) mollen/minuut/mg eiwit. De Vmax wordt bepaald door hoeveel enzymplaatsen aanwezig zijn (Et) en de snelheid waarmee het enzym substraat in product (kcat) kan omzetten.
Als u de concentratie van enzymplaatsen kent die u aan de test (Et) hebt toegevoegd, kunt u de katalytische constante Kcat aanpassen met behulp van het bovenstaande model.
bij de berekening van Kcat heffen de concentratie-eenheden elkaar op, zodat Kcat wordt uitgedrukt in eenheden van inverse tijd. Het is het omzetgetal — het aantal substraatmolecule dat elke enzymplaats in product per tijdseenheid omzet.
passend bij het model met prisma
1.Maak een XY-gegevenstabel. Voer substraat concentratie in X, en enzymsnelheid in Y. Als je verschillende experimentele omstandigheden, plaats de eerste in kolom A, de tweede in kolom B, enz. Je kunt ook Prism ‘ s sample data kiezen: Enzyme kinetics — Michaelis-Menten.
2.Nadat u gegevens hebt ingevoerd, klikt u op Analyseren, kiest u niet-lineaire regressie, kiest u het paneel met enzymkinetiekvergelijkingen en kiest u Kcat.
3.Je moet Et beperken tot een constante waarde, gebaseerd op andere experimenten. Om de waarde van Et te beperken, gaat u naar het tabblad beperken van het dialoogvenster niet-lineaire regressie, zorg ervoor dat de drop-down naast Et is ingesteld op “Constant gelijk aan” en voer de waarde in. Voer voor de steekproefgegevens 100 in als de waarde van Et.
Als u de waarde van Et niet kent, kunt u niet in de kcat passen, maar moet u in plaats daarvan in de Vmax passen. Het is niet mogelijk voor Prisma om zowel de Kcat en Et te passen, aangezien de twee parameters met elkaar verweven zijn, en een substraatsnelheidscurve geen informatie geeft over hun individuele waarden.
4.Met de steekproefgegevens rapporteert Prism dat Km = 5,886 met een 95% betrouwbaarheidsinterval variërend van 3,933 tot 7,839. De best passende waarde van kcat is 13,53 met een 95% betrouwbaarheidsinterval variërend van 11,97 tot 15,09.
Notes
•zie de lijst van veronderstellingen van alle analyses van enzymkinetiek.
•deze vergelijking past precies in dezelfde curve als de vergelijking die past bij Vmax, in plaats van het omzetgetal Kcat. Het product van Kcat keer Et (de concentratie van enzymplaatsen) is gelijk aan de Vmax.
•deze vergelijking is gerelateerd aan de vergelijking voor allosterische enzymen. Dat allosterische model voegt een extra parameter toe: de heuvel helling h. wanneer h gelijk is aan 1.0, zijn de twee modellen identiek.