introductie
fossiele hulpbronnen zijn de belangrijkste grondstof voor energie en organische verbindingen, en het gebruik ervan resulteert in de uitstoot van broeikasgassen in verband met klimaatverandering. De komende klimaatcrash vraagt om een dringende overgang van een fossiele naar een biogebaseerde economie waarin lignocellulose biomassa in plaats van olie wordt gebruikt voor de productie van brandstoffen, chemicaliën en materialen. Hout is een belangrijke bron van lignocellulose biomassa; het is voornamelijk samengesteld uit secundaire verdikte celwanden rijk aan cellulose, hemicelluloses en lignine. Alle drie de polymeren kunnen worden benut in de bio-based economy. Cellulose is een bron voor de pulp-en papierindustrie, en zowel cellulose als hemicellulose kunnen worden gedepolymeriseerd tot hun monosachariden voor fermentatie in bijvoorbeeld bio-ethanol, melkzuur en detergentia (Vanholme et al., 2013b). Aangezien lignine een negatieve invloed heeft op de efficiëntie van de houtverwerking voor deze toepassingen, kunnen bomen worden ontworpen om minder lignine te accumuleren, om meer vatbaar te worden voor de productie van papier en vergistbare suikers. Aan de andere kant wordt lignine steeds meer beschouwd als een waardevolle component in de biogebaseerde economie. Aangezien lignine de grootste hernieuwbare aromatische bron op aarde is, kan de economische levensvatbaarheid van een bioraffinaderij aanzienlijk worden verhoogd als lignine ook wordt benut en wordt gebruikt als grondstof voor de productie van chemicaliën (Holladay et al., 2007; Tuck et al., 2012; Davis et al., 2013; Ragauskas et al., 2014; Li C. et al., 2015; Van den Bosch et al., 2015; Rinaldi et al., 2016; Upton and Kasko, 2016; Schutyser et al., 2018).
het ligninepolymeer is samengesteld uit monolignolen die worden geproduceerd door de biosynthetische routes fenylpropanoide en monolignol, door een reeks enzymatische reacties te beginnen met de deaminatie van fenylalanine (figuur 1). De monolignolen worden gesynthetiseerd in het cytoplasma en getransloceerd naar de apoplast, waar ze gedehydrogeneerd worden tot monolignolradicalen door de werking van laccases en peroxidasen (Berthet et al., 2011; Zhao et al., 2013). Deze monolignolradicalen paren dan op een combinatorische manier met elkaar en genereren een reeks chemische bindingen zoals de aryl-etherbinding (β-o-4), resinolbinding (β-β) en fenylcumaraanbinding (β-5) (Boerjan et al., 2003; Ralph et al., 2004; Vanholme et al., 2010). De meest voorkomende monolignolen zijn de hydroxycinnamylalcoholen p-cumaryl, coniferyl en sinapylalcoholen, die de H -, G-en S-eenheden genereren bij hun opname in het ligninepolymeer, respectievelijk (Bonawitz and Chapple, 2010; Ralph et al., 2019; Vanholme et al., 2019). De relatieve bijdrage van de lignine bouwstenen varieert tussen taxa, ontwikkelingsstadium, weefsel en celtype, en zelfs celwandlaag; lignine uit zachthout (gymnosperms) bestaat bijna volledig uit g-eenheden met een kleine fractie van H-eenheden, terwijl lignine uit hardhout (angiosperms) S-eenheden heeft naast g-eenheden en sporen van H-eenheden (Boerjan et al., 2003; Vanholme et al., 2010, 2019). Naast deze traditionele monolignolen kan een verscheidenheid aan andere P-gehydroxyleerde aromatische moleculen in het ligninepolymeer tot verschillende niveaus worden opgenomen (Vanholme et al., 2019).
Figure 1. Lignin biosynthetic pathway. Alternative monomers and heterologously expressed enzymes are shown in bold. PAL, phenylalanine ammonia-lyase; C4H, cinnamate 4-hydroxylase; 4CL, 4-coumarate:CoA ligase; HCT, p-Hydroxycinnamoyl-CoA:quinate/shikimate-p-hydroxycinnamoyltransferase; C3’H, p-coumaroyl quinate/shikimate 3’-hydroxylase; CSE, caffeoyl shikimate esterase; CCoAOMT, caffeoyl-CoA O-methyltransferase; CCR, cinnamoyl-CoA reductase; F5H, ferulate 5-hydroxylase/CAld5H, coniferaldehyde 5-hydroxylase; COMT, caffeic acid O-methyltransferase; CAD, cinnamyl alcohol dehydrogenase; FMT, feruloyl-CoA monolignol transferase; PMT, p-cumaroyl-CoA monolignol transferase.aangezien lignine een belangrijke recalcitrancefactor is in houtdelignificatieprocessen, zijn grote onderzoeksinspanningen verricht om de biosynthetische route van lignine te ontrafelen en de effecten van verstoringen van de biosynthesegenen van lignine op de hoeveelheid en samenstelling van lignine en op de efficiëntie van de houtverwerking te bestuderen. Terwijl wijzigingen in genen variërend van die coderen transcriptiefactoren tot die coderen oxidatieve enzymen hebben geresulteerd in veranderde ligninegehalte, samenstelling of depositie (Eriksson et al., 2000; Li Y. H. et al., 2003; Liang et al., 2008; Lu et al., 2013; Lin et al., 2016; Xu et al., 2017; Yang et al., 2017; Obudulu et al., 2018), zal dit overzicht zich richten op de resultaten verkregen door de engineering van de lignine biosynthetische genen.
Engineering The lignine Pathway
Tabel 1 geeft een overzicht van de verschillende studies naar downregulated of gemuteerde lignine biosynthetische genen in populier, den, eucalyptus en berk, met de daaruit voortvloeiende effecten op de houtverwerkingsefficiëntie, indien bepaald. Het verminderen van de activiteit van elke stap van de lignine biosynthetische route, beginnend van PAL tot CAD, kan resulteren in een vermindering van het ligninegehalte (Tabel 1). Verscheidene parameters beà nvloeden de graad van ligninevermindering, zoals het doelgen en de graad van downregulation van de enzymactiviteit, die op zijn beurt afhangt van de efficiency van de gebruikte het tot zwijgen brengen construct, de grootte van de genfamilie, en redundantie binnen de genfamilie. Over het algemeen leidt de lagere regulering van de stappen van C4H tot CCR tot een dramatischer vermindering van de ligninehoeveelheid (Hu et al., 1999; Meyermans et al., 2000; Zhong et al., 2000; Li L. et al., 2003; Jia et al., 2004; Lu et al., 2004; Leplé et al., 2007; Coleman et al., 2008a, b; Bjurhager et al., 2010; Mansfield et al., 2012; Ralph et al., 2012; Min et al., 2014; Van Acker et al., 2014; Zhou et al., 2015, 2018; Saleme et al., 2017; Xiang et al., 2017) dan downregulation van F5H, COMT en CAD (van Doorsselaere et al., 1995; Baucher et al., 1996; Lapierre et al., 1999; Jouanin et al., 2000; Van Acker et al., 2014; Wang et al., 2018). Ligninevermindering kan in verband worden gebracht met een toename van S/G, zoals in C3 ‘ h- (Coleman et al., 2008a; Ralph et al., 2012) en ccoaomt-neergestorte bomen (Meyermans et al., 2000), of een daling van de S / G-verhouding zoals in CSE – (Saleme et al., 2017), en Comt-downregulated trees (van Doorsselaere et al., 1995; Lapierre et al., 1999; Jouanin et al., 2000). Interessant is dat laag-lignine 4CL-downregulated populieren een toename van S/G (Min et al., 2014; Xiang et al., 2017), een daling van S / G (Voelker et al., 2010; Zhou et al., 2015), of verhoudingen vergelijkbaar met wild type (Hu et al., 1999; Li L. et al., 2003). Deze variantie kan niet worden geassocieerd met de promotor of de methode die wordt gebruikt voor downregulatie, wat suggereert dat verschillen in de mate van het tot zwijgen brengen, groeiomstandigheden of ontwikkelingsstatus deze eigenschap beïnvloeden. Aan de andere kant zijn de sterkste effecten op de samenstelling van H/G/S lignine waargenomen bij neergestorte bomen in C3 ‘ H en HCT, die lignine deponeren met een sterke toename van het H-eenheidsgehalte (Coleman et al., 2008a; Ralph et al., 2012; Vanholme et al., 2013a), terwijl bomen die overexpress F5H produceren lignine sterk verrijkt in S eenheden (Franke et al ., 2000; Li L. et al., 2003; Stewart et al., 2009), en bomen die zijn neergereguleerd in COMT hebben drastisch verminderd s eenheid biosynthese (van Doorsselaere et al., 1995; Lapierre et al., 1999).
Tabel 1. Overzicht van bosbomen met gemodificeerde expressie van lignine biosynthese genen.
de verwerkingsefficiëntie van de biomassa kan ook worden gewijzigd door de verhoogde opname van moleculen die over het algemeen kleine componenten vertegenwoordigen in de lignine van wilde planten. De incorporatie van ferulinezuur in bomen met CCR-deficiëntie leidt tot de vorming van acetaalbindingen in het ligninepolymeer, die gemakkelijk kunnen worden gesplitst in zure biomassapreatments (Leplé et al., 2007; Ralph et al., 2008; Van Acker et al., 2014). De gehalten aan ferulinezuur in lignine waren inderdaad positief gecorreleerd met een hogere sacharificatie-efficiëntie (van Acker et al., 2014). De incorporatie van 5-hydroxyconiferylalcohol en 5-hydroxyconiferaldehyde in de lignine van populieren met een COMT-deficiëntie (van Doorsselaere et al., 1995; Lapierre et al., 1999; Jouanin et al., 2000; Morreel et al., 2004; Lu et al., 2010) leidt tot benzodioxaanbindingen, die mogelijk covalente verbindingen tussen lignine en de polysaccharidehydroxylgroepen voorkomen (Weng et al., 2010; Vanholme et al., 2012; Nishimura et al., 2018). Aan de andere kant resulteert Comt-deficiëntie ook in een meer gecondenseerde lignine als gevolg van de relatief hogere niveaus van de gecondenseerde b-β-En β-5-bindingen en de lagere niveaus van β-O-4-bindingen, wanneer de S-eenheidsfrequentie daalt. Het chemisch verpulveren van hout afkomstig van populieren die sterk zijn neergereguleerd voor COMT, resulteerde in een hogere pulpopbrengst, gecompenseerd door het resterende ligninegehalte in de pulp. Deze bomen hadden een lager ligninegehalte en een hoger cellulosegehalte (Jouanin et al., 2000). Aan de andere kant hadden populieren die voor COMT bescheiden waren verlaagd, een grote daling van de pulpopbrengst, vermoedelijk omdat het ligninegehalte normaal was gebleven, terwijl de lignine een hogere frequentie van gecondenseerde bindingen had die de lignineextractie negatief beïnvloedden (Lapierre et al., 1999; Pilate et al., 2002). De incorporatie van cinnamaldehyden in het ligninepolymeer in bomen met CAD-deficiëntie resulteert in kortere ligninepolymeerketens, vandaar een groter aandeel van vrije fenolische eindgroepen die de oplosbaarheid van het polymeer in alkali verhogen. De incorporatie van cinnamaldehyden in het ligninepolymeer vermindert vermoedelijk ook de covalente interactie van de alifatische keten met hemicellulose, waardoor de lignine weer oplosbaarder wordt. Bovendien, als gevolg van het uitgebreide geconjugeerde systeem dat wordt gegenereerd wanneer een Cinnamaldehyde β-o-4 paren met een ander monomeer, de aromatische ether binding van de opgenomen cinnamaldehyde wordt gevoeliger voor alkalische splitsing (Lapierre et al., 1989; Van Acker et al., 2017).
Ligninepolymerisatie is een combinatorisch radicaal koppelingsproces, waardoor een breed scala aan fenolverbindingen op natuurlijke wijze kan worden opgenomen in het ligninepolymeer (Boerjan et al., 2003; Vanholme et al., 2019). Onderzoekers hebben geprobeerd de ligninehoeveelheid en samenstelling aan te passen om de biomassaverwerking te verbeteren door expressie van heterologe genen, gericht op de biosynthese en incorporatie van verschillende compatibele fenolverbindingen als alternatieve monolignolen in het ligninepolymeer (Ralph, 2006; Vanholme et al., 2012; Mottiar et al., 2016; Mahon and Mansfield, 2018). Een voorbeeld is de introductie van genen die enzymen coderen die nodig zijn voor de biosynthese van S-eenheden in pine; de gelijktijdige expressie van F5H, COMT en CAD introduceerde met succes S-eenheden in Pinus radiata (Wagner et al., 2015; Edmunds et al., 2017). De introductie van het gen dat codeert voor een monolignol-4-o-methyltransferase (MOMT4) in populier leidt tot de vorming van 4-o-gemethyleerde coniferyl-en sinapylalcoholen, die niet in het groeiende ligninepolymeer kunnen worden opgenomen omdat zij de aromatische hydroxylgroep missen. Dit leidt tot een halt in ligninepolymerisatie en resulteert in bomen met een lager ligninegehalte en een hogere sacharificatie-efficiëntie (Bhuiya and Liu, 2010; Cai et al., 2016). Populieren zijn ook ontworpen om esterbindingen in de ligninepolymeer backbone te bevatten. Coniferylferulaat esters werden geïntroduceerd in het polymeer via expressie van een FERULOYL-CoA: MONOLIGNOL TRANSFERASE (FMT) gen afgeleid van Angelica sinensis (Wilkerson et al., 2014), wat leidt tot een verbeterde sacharificatie-efficiëntie onder verschillende voorbehandelingsomstandigheden (Wilkerson et al., 2014; Kim et al., 2017; Bhalla et al., 2018), en een verbeterde Kraft pulping efficiëntie in vergelijking met wild type (Zhou et al., 2017). Monolignol p-cumaraat esters zijn ook geproduceerd in populier, via expressie van een rijst P-CUMAROYL-CoA:MONOLIGNOL TRANSFERASE (PMT) gen, resulterend in een hogere frequentie van resistente interunit bindingen en een hogere frequentie van G en S Terminale eenheden met vrije fenolische groepen (Smith et al., 2015; Sibout et al., 2016). Terwijl in Arabidopsis de heterologe uitdrukking van PMT resulteerde in een verminderde ligninehoeveelheid vergezeld van een verhoogde sacharificatie-efficiëntie (Sibout et al., 2016), was er geen daling van de ligninehoeveelheid in populier en de sacharificatie-efficiëntie werd niet bepaald (Smith et al., 2015).
hoewel verscheidene wijzigingen van de ligninehoeveelheid en-samenstelling een verbetering van de biomassaverwerking opleverden, gingen deze wijzigingen vaak gepaard met een boete voor de opbrengst van biomassa (Leplé et al., 2007; Wadenbäck et al., 2008; Wagner et al., 2009; Voelker et al., 2010; Stout et al., 2014; Van Acker et al., 2014; Sykes et al., 2015; Zhou et al., 2018). Een recente metastudy verstoorde 21 lignine biosynthese genen in P. trichocarpa, en integreerde uitgebreid de resultaten van transcriptomic, proteomic, fluxomic, en phenomic gegevens van 221 lijnen. De auteurs concludeerden dat boomgroei niet geassocieerd is met lignine hoeveelheid, subeenheid samenstelling of specifieke verbanden (Wang et al., 2018), maar eerder gecorreleerd met de aanwezigheid van ingestorte Xylem schepen (Coleman et al., 2008a, B; Wagner et al., 2009; Voelker et al., 2010; Vargas et al., 2016; De Meester et al., 2018), de activering van een celwandintegriteitstraject (Bonawitz et al., 2014) en / of de accumulatie van chemische remmers (Gallego-Giraldo et al., 2011; Muro-Villanueva et al., 2019).hoewel aanzienlijke inspanningen zijn geleverd om het ligninegehalte te verlagen door downregulatie van de biosynthetische genen van lignine, zijn studies naar de upregulatie van de lignineroute en de overproductie van lignine schaars geweest. Uit rapporten over de overexpressie van F5H blijkt inderdaad dat het ligninegehalte onveranderd of zelfs gedaald is (Huntley et al., 2003; Li L. et al., 2003; Stewart et al., 2009; Mansfield et al., 2012; Edmunds et al., 2017). De overexpressie van CAD en COMT heeft geresulteerd in gen-het tot zwijgen brengen eerder dan upregulation, of geen effect op uitdrukkingsniveaus werd ontdekt (Baucher et al., 1996; Lapierre et al., 1999; Jouanin et al., 2000; Leplé et al., 2007; Van Acker et al., 2014). De overexpressie van de r2r3-MYB transcriptiefactoren PtoMYB92, PtoMYB216 en PtoMYB74 resulteerde allemaal in extra Xylem-lagen, dikkere Xylem-celwanden en ectopische ligninedepositie, en de planten accumuleerden 13-50% meer lignine (Tian Q. et al., 2013; Li C. F. et al., 2015; Li et al., 2018). De overexpressielijnen van MYB hebben de lignine biosynthese pathway genen constitutief verhoogd, en terwijl planten die MYB92 en MYB74 overexpresteren een biomassabijdrage hadden, resulteerde de overexpressie van MYB216 in planten met tot 50% meer lignine en geen ontwikkelingsfenotype. Aangezien lignine steeds meer wordt beschouwd als een belangrijke hulpbron voor de duurzame productie van chemicaliën (Cao et al., 2018) de engineering van installaties die lignine overproduceren moet verder worden onderzocht.
veldproeven
de hierboven besproken voorbeelden tonen duidelijk aan dat lignine – engineering via down – of upregulatie van fenylpropanoide pathway genen – of expressie van heterologe genen-het potentieel heeft om de verwerkingsefficiëntie van lignocellulose biomassa te verhogen. Om praktische en regelgevende redenen rapporteren de meeste studies over gegevens die zijn verkregen uit de analyse van bomen die in een kas worden geteeld. Experimenten met bomen die in een kas worden geteeld houden echter meestal geen rekening met ontwikkelingsprocessen zoals het stoppen van de groei en de rustperiode. Daarnaast bieden kasexperimenten onvoldoende inzicht in de interactie van de engineered plant met omgevingsfactoren zoals bodemtype, wind en ziekteverwekkers. Het begrijpen van deze interacties is een belangrijke stap in de vertaling van onderzoeksresultaten naar commerciële toepassingen. Uit het werk dat is verricht door studies waarvoor toestemming is verleend om veldproeven uit te voeren, blijkt namelijk dat er belangrijke verschillen zijn in fenotype tussen in de kas en in het veld geteelde bomen. Tabel 1 geeft een samenvatting van de rapporten over veldproeven uitgevoerd met 4CL, CCoAOMT, CCR, COMT en CAD downregulated bomen.
ter bevestiging van het potentieel van gemodificeerde lignocellulose biomassa als substraat voor toepassingen, toonden verschillende door lignine vervaardigde veldproeven geteelde bomen verbeteringen in de houtverwerking. Populieren downregulated voor ccoaomt gegroeid voor 5 jaar in een veldproef in Beijing (China), toonde een verhoogde glucose en xylose release na saccharification (Wang et al., 2012). Populieren die voor CCR zijn neerreguleerd en in een veldproef in Frankrijk zijn geteeld, bleken meer vatbaar te zijn voor chemische Kraft-pulping (Leplé et al., 2007). Twee extra veldproeven uitgevoerd in Frankrijk en België met CCR-downregulated populieren resulteerden in tot 160% verbetering van de ethanolproductie in simultaneous saccharification and fermentation (SSF) assays; de planten hadden echter tot 50% reductie van de biomassa (Van Acker et al., 2014). Veldproeven met CAD-downregulated populier toonden ook veelbelovende resultaten. Deze bomen vertoonden iets minder lignine dan wilde soorten en bleken meer vatbaar voor Kraft delignificatie (Lapierre et al., 1999). Dezelfde lijnen die in veldproeven op grotere schaal in Frankrijk en het Verenigd Koninkrijk werden geteeld, vertoonden consequent een lichte daling van de ligninehoeveelheid en een verbetering van de verpulping van kraftpapier die commercieel relevant werd geacht, aangezien de planten 6% minder alkali nodig hadden om tot een delignificatie te komen die vergelijkbaar is met die van wilde bomen (Pilate et al., 2002).
uit tegenstrijdige rapporten over zowel de opbrengst van biomassa als de efficiëntie van de downstreamverwerking blijkt echter dat deze parameters sterk worden beïnvloed door omgevingsfactoren. Terwijl een veldonderzoek uitgevoerd in China met 4CL downregulated populieren bleek dat, zelfs met een 28% daling van ligninegehalte in vergelijking met wilde type, de bomen had ongeveer 8% toegenomen hoogte (Tian X. M. et al., 2013), consistent met kasstudies (Hu et al., 1999), bleek uit andere veldproeven dat 4CL-downregulated populieren de biomassa hadden verminderd en soms zelfs klein waren (Voelker et al., 2010; Stout et al., 2014; Marchin et al., 2017). De verslagen lopen ook uiteen met betrekking tot de downstreamverwerkingsefficiëntie van hout dat afkomstig is van deze 4CL-downregulated veldpopulieren. Terwijl tot 100% toename van suiker herstel werd gevonden voor 4cl1-downregulated bomen (35S-gedreven antisense 4CL construct) geteeld in een berg site in de Verenigde Staten (Xiang et al., 2017), gegevens verkregen uit veldstudies uitgevoerd in Oregon (Verenigde Staten) bleek dat pt4cl1 promotor-driven antisense silenced 4cl1 populieren had geen verbetering in saccharification efficiency in vergelijking met wild type (Voelker et al., 2010). Evenzo, een lange termijn studie in Wenling (China), bleek dat 4CL-downregulated populieren geen significante verbetering van suikeropbrengst in vergelijking met wild type (Wang et al., 2012). In beide laatste gevallen vertoonden de bomen een lichte daling van de ligninehoeveelheid die zich niet vertaalde in een hogere verwerkingsefficiëntie, mogelijk als gevolg van de hogere concentratie extracten die de enzymatische activiteit zouden kunnen verstoren (Voelker et al., 2010).
veldonderzoek heeft aangetoond dat omgevingsfactoren de lignificatie kunnen beïnvloeden en de eigenschappen kunnen herstellen tot wild-type niveaus in vergelijking met de niveaus die worden bereikt wanneer dezelfde planten in de kas werden geteeld. Terwijl de 4CL-downregulated bomen het ligninegehalte hadden verlaagd wanneer ze onder kasomstandigheden werden geteeld, heeft analyse van dezelfde 4CL antisense populieren, maar die in het veld werden geteeld, vaak aangetoond dat het ligninegehalte was verhoogd in vergelijking met de in Kas geteelde bomen en soms zelfs hersteld tot wild-type niveaus (Stout et al., 2014; Xiang et al., 2017). Op dezelfde manier werden ligninespiegels veel minder verlaagd in CCR-deficiënte populieren wanneer ze in het veld werden geteeld in vergelijking met wanneer ze in de kas werden geteeld (Van Acker et al., 2014). Ten minste voor de populieren met CCR-deficiëntie is het mogelijk dat het hogere lignificatieniveau van in het veld geteelde bomen te wijten is aan het feit dat de houtmonsters in de winter zijn genomen. Wanneer de boomgroei in de herfst stopt, hebben de bomen nog steeds tijd om hun celwanden volledig te verlijmen tegen de tijd dat de boom in slaap valt, in vergelijking met in de kas geteelde bomen die continu nieuwe xylem ontwikkelen. Ook is aangetoond dat de samenstelling van lignine verschilt tussen in de kas en in het veld geteelde laag ligninebomen. 4CL-downregulated populieren geteeld in een veld in North Carolina had lignine met een lagere S / G dan wanneer dezelfde lijnen werden geteeld in de kas (Stout et al., 2014).
samen tonen deze resultaten aan dat gegevens die zijn verkregen van in broeikasgassen geteelde bomen niet gemakkelijk kunnen worden geëxtrapoleerd naar in het veld geteelde bomen, wat de noodzaak van veldproeven op verschillende locaties onderbouwt. Sommige lijnen presenteerden een opbrengststraf waardoor ze minder interessant zijn voor toepassingen, waarbij de noodzaak werd benadrukt voor een beter begrip van de moleculaire basis van de opbrengststraf en de ontwikkeling van strategieën om dit probleem te overwinnen.van lignine is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt bij resistentie tegen pathogenen (Miedes et al., 2014; Zhao and Dixon, 2014), en het speelt een centrale rol in het toestaan van de plant om water te transporteren. Dit wijst erop dat wijzigingen in lignine van invloed kunnen zijn op de tolerantie voor plantstress. Hoewel verder onderzoek nodig is om deze mogelijkheid volledig aan te pakken, heeft de downregulatie van 4CL, COMT en CAD in populieren de voedingsprestaties van bladvoedende herbivoren (Tiimonen et al., 2005; Brodeur-Campbell et al., 2006; Hjalten et al., 2013). Het effect van de downregulatie van COMT en CAD in populier op de interacties tussen planten en insecten is ook beoordeeld op in het veld geteelde bomen, en er werd aangetoond dat de lignine-gemodificeerde bomen normale incidentie van bezoekende en voedende insecten hadden, evenals normale reacties op microbiële pathogenen (Pilate et al., 2002; Halpin et al., 2007). Uit deze resultaten blijkt dat bomen met gemodificeerde lignine niet noodzakelijkerwijs meer dan wilde planten lijden aan plagen en ziekten. Niettemin, het profileren van de endosphere bacteriële microbioom van hout geoogst van veld-geteelde, CCR-downregulated populieren toonde verschuivingen in de bacteriële gemeenschap, vermoedelijk als gevolg van de veranderde overvloed van bepaalde fenolische metabolieten in de xylem (Beckers et al., 2017).
rekening houdend met de rol van lignine in de xylem-functie en-structuur, zijn de waterrelaties van enkele laag-lignine-gemodificeerde populieren beoordeeld. 4CL-downregulated populieren bleken te hebben verminderde hydraulische geleidbaarheid, mogelijk interfereren met plantengroei (Marchin et al., 2017). Hydraulische stress experimenten met populieren downregulated voor CCR, COMT of CAD toonden aan dat deze planten hadden een lagere weerstand tegen cavitatie, met behoud van normale Xylem hydraulische geleidbaarheid en water transport (Awad et al., 2012). Deze resultaten wijzen erop dat de groei van mutanten met een laag ligninegehalte kan worden beïnvloed door de beschikbaarheid van water. Zoals voor elke nieuwe hybride die uit de klassieke kweek wordt verkregen, zijn veldproeven nodig om de veldprestaties en de spanningstolerantie van lignine-geboomte bomen te evalueren.
vooruitzichten voor lignine-Engineering in bosbomen
de prestaties van lignine-engineeringinstallaties lijken sterk te worden beïnvloed door de omgevingsomstandigheden. Het is echter onduidelijk of de waargenomen verschillen tussen in de kas geteelde en in het veld geteelde bomen, of tussen bomen geteeld in verschillende veldlocaties, het gevolg zijn van verschillende niveaus van genonderdrukking of Van interactie van de gemanipuleerde eigenschap met de omgeving (GxE). Inderdaad, is de onstabiele downregulation een tekortkoming van gen het tot zwijgen brengen technieken die op RNAi worden gebaseerd. Dit wordt getuigd door variatie in het Rode Xylem fenotype waar te nemen dat wanneer bepaalde ligninebiosynthesegenen, zoals CAD, COMT, of CCR, worden downregulated. De rode Xylem kleuring is vaak niet uniform in de xylem, maar eerder verschijnt in patches die variabele niveaus van Gen silencing weerspiegelen (Leplé et al., 2007; Voelker et al., 2010; Van Acker et al., 2014; Figuur 2). Bovendien, kan het gebruik van gen het tot zwijgen brengen methodes mogelijk in het gelijktijdig tot zwijgen brengen van nauw verwante leden van de genfamilie resulteren-misschien in diverse graden-vertroebeld de interpretaties en het camoufleren van de gevolgen van downregulation van individuele genen.
Figuur 2. Fragmentarisch gen downregulation door RNAi. Fragmentarisch rood Xylem fenotype waargenomen op stammen van CCR-deficiënte populieren (rechts) gekweekt in een veldonderzoek in België. De rode xylem geeft gebieden van CCR downregulation aan. Hout van wilde bomen is Wittig (links).
deze problemen kunnen nu gemakkelijk worden opgelost door het gebruik van CRISPR-gebaseerde genbewerkingstechnologieën die stabiele verlies-van-functiemutaties (knock-outs) in specifieke doelgenen mogelijk maken, waardoor de functie van individuele genen binnen families kan worden ontleed. Bijvoorbeeld, toonde het richten van individuele 4CL genfamilie leden in populier aan dat 4CL1 aan lignificatie gerelateerd is, terwijl 4CL2 bij proanthocyanidin productie betrokken is (Zhou et al., 2015). Naast knock-out allelen, CRISPR-gebaseerde gen het uitgeven staat ook toe om nieuwe allelen te creëren die gedeeltelijke vermindering van enzymactiviteit verlenen. Dit opent de mogelijkheid om het niveau van de residuele enzymactiviteit te verfijnen en de opbrengststraf te omzeilen die vaak wordt waargenomen wanneer de ligninehoeveelheid onder een drempelwaarde daalt. Een andere veelbelovende weg voor lignine engineering in bosbomen mogelijk gemaakt door CRISPR-gebaseerde genoom engineering is het gelijktijdig bewerken van meerdere genen (allel stacking) om de efficiëntie van biomassaverwerking te optimaliseren, zoals geïllustreerd in Arabidopsis waar het stapelen van de transaldolase (tra) en Comt mutaties, de C4H en comt mutaties, of de 4CL en comt mutaties resulteerde in additieve en synergistische verbeteringen in saccharification efficiency (De Vries et al., 2018). Inderdaad, een systeembenadering in P. trichocarpa voorspelt dat de gelijktijdige downregulatie van PAL en CCoAOMT, of PAL, C3 ‘ H en CCOAOMT de houteigenschappen en het vrijkomen van suiker aanzienlijk zal verbeteren (Wang et al., 2018).
het gebruik van op CRISPR gebaseerde genoombewerking bij de verbetering van bomen voor de pulp-en papierindustrie en de bioraffinaderijen, alsmede voor de productie van platformaromatica uit de hydrogenolytische afbraak van lignine, zal het meest waardevol zijn wanneer deze technologie strategisch wordt gecombineerd met andere kweektechnieken (Figuur 3). Er bestaat al een grote variatie in ligninehoeveelheid en S / G-samenstelling in natuurlijke populaties van bosbomen (Studer et al., 2011). Gezien het feit dat beide eigenschappen van invloed zijn op de glucose-afgifte bij saccharificatie (Yoo et al., 2018), het benutten van deze genetische diversiteit door conventioneel fokken, geholpen door Genome Wide Association Studies (GWAS) (Porth et al., 2013; Fahrenkrog et al., 2017; Liu et al., 2018), fokken met zeldzame defecte allelen (BRDA) (Vanholme et al., 2013a) of genomische selectie (Yin et al., 2010; Muchero et al., 2015; Pawar et al., 2018; Xie et al., 2018), is een waardevolle strategie om lijnen te verkrijgen die de efficiëntie van de houtverwerking hebben verbeterd. Zodra elite bomen zijn verkregen door deze fokmethoden, genetische engineering en CRISPR-gebaseerde gen editing van specifieke genen is een veelbelovende manier om deze elite genotypes verder te verbeteren zonder breken hun genetische constitutie en zonder te gaan door lange fokcycli. Gezien de dreigende klimaatcrash hebben we geen tijd meer te verliezen om deze nieuwe kweektechnieken over te nemen in onze race naar de biobased economy.
Figuur 3. Genetische verbetering van bosbomen door een combinatie van fokhulpmiddelen. Om de genetische verbetering van bosbomen voor pulp-en bioraffinagetoepassingen te versnellen, moeten klassieke en nieuwe fokinstrumenten slim worden gecombineerd. Het klassieke fokken omvat fenotypische selectie van bomen voor gecontroleerde kruisingen, gevolgd door fenotypische selectie. Met de komst van de informatie van de genoomopeenvolging van vele bosbomen, zijn nieuwe strategieën zoals Genomic selectie, genoom brede Associatiestudies (GWAS) en het kweken met zeldzame defecte allelen (BRDA) ontwikkeld om de vangst en verrijking van de polymorfismen van DNA te versnellen die met voordelige eigenschappen worden geassocieerd. Het CRISPR-gebaseerde genoom uitgeven staat toe om het genoom op een manier te wijzigen die natuurlijke polymorfismen nabootst. Genetische modificatie impliceert de stabiele integratie van vreemd DNA in de boom om (een) enzym(s) te overproduceren of (een) gen(s) te downreguleren. Het combineren van de klassieke en nieuwe kweektechnieken is nodig om voldoende hoogwaardig hout voor de samenleving te leveren.
Auteursbijdragen
alle genoemde auteurs hebben een aanzienlijke, directe en intellectuele bijdrage aan het werk geleverd en het voor publicatie goedgekeurd.
financiering
wij erkennen gedeeltelijke financiering van het IWT-SBO-Project BIOLEUM (subsidie nr. 130039) en van SBO-FISH via het ARBOREF-project. AC heeft financiering ontvangen van het FWO en het onderzoeks-en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie subsidieovereenkomst nr. 665501. LDV werd gefinancierd door het Instituut voor de bevordering van innovatie door wetenschap en technologie in Vlaanderen (IWT-Vlaanderen) voor een predoctorale fellowship.
belangenconflict verklaring
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relatie die als een potentieel belangenconflict kon worden opgevat.
Dankbetuigingen
Wij danken Annick Bleys voor het voorbereiden van dit manuscript.
Boerjan, W., Ralph, J., and Baucher, M. (2003). Lignine biosynthese. Annu. Rev. Plant Biol. 54, 519–546.
PubMed Abstract / Google Scholar
Lapierre, C., Pollet, B., Petit-Conil, M., Toval, G., Romero, J., Pilate, G., et al. (1999). Structurele veranderingen van ligninen in transgene populieren met gedeprimeerde cinnamylalcohol dehydrogenase of cafeïnezuur o-methyltransferase activiteit hebben een tegengestelde invloed op de efficiëntie van industriële Kraft pulping. Plantenfysiol. 119, 153–163.
PubMed Abstract / Google Scholar
Ralph, J. (2006). “Wat maakt een goede monolignol substituut?, “in The Science and Lore of the Plant Cell Wall-biosynthese, Structure and Function, ed. T. Hayashi (Boca Raton, FL: BrownWalker Press).
Google Scholar