Er is vaak veel verwarring over de Betekenis van ‘enzymeenheden’, ‘enzymactiviteit’ en ‘Specifieke enzymactiviteit’. Deze gids legt deze sleutelbegrippen in eenvoudige termen uit en bespreekt het ontwerp van de enzyme assay en het belang van het werken in het ‘lineaire bereik’. We overwegen ook standaardcurves en of je concentratie of absolute hoeveelheid product op de x-as moet plotten. Sommige uiteinden bij het opzetten van testcontroles en het aftrekken van blanks worden besproken. Tot slot leggen we uit hoe enzymactiviteit waarden worden berekend en geven we een eenvoudig overzicht van kinetische vergelijkingen.
definities van Enzymeenheden
enzymologie zou minder ingewikkeld zijn als iedereen dezelfde eenheidsdefinitie zou gebruiken. Een standaardeenheid definitie wordt hieronder gegeven:
1 eenheid (U) is de hoeveelheid enzym die de reactie van 1 umol substraat per minuut katalyseert (definitie A).
in de meeste R&D instellingen, 1 umol van substraat is eigenlijk heel veel materiaal en andere definities kunnen de voorkeur krijgen om te voorkomen dat hoeveelheden in fracties van eenheden worden uitgedrukt. De volgende niet-standaarddefinitie wordt vaak gebruikt:
1 eenheid (U) is de hoeveelheid enzym die de reactie van 1 nmol substraat per minuut katalyseert (definitie B).
merk op dat de verandering in de definitie een diepgaand effect heeft op het opgegeven aantal eenheden, dat wil zeggen dat 1 eenheid enzym volgens definitie A gelijk zou staan aan 1000 eenheden volgens definitie B!
u kunt ook enzymeenheden zien die worden uitgedrukt als milli-eenheid (of mU), wat simpelweg een duizendste van een eenheid betekent, ongeacht hoe de eenheid is gedefinieerd.
Het is duidelijk dat de werkelijke hoeveelheid van een enzym in een buis niet wordt gewijzigd door simpelweg de eenheidsdefinitie te wijzigen, maar dat voorzichtigheid geboden is bij het vergelijken van de activiteiten van monsters van verschillende leveranciers. Zolang de eenheidsdefinities worden gegeven kunt u het opgegeven aantal eenheden omzetten in nmol per min, wat ondubbelzinnig is en geldige vergelijkingen mogelijk maakt.
voor de duidelijkheid in uw eigen werk kunt u de voorkeur geven aan’ nmol per min ‘(of’ umol per min’), maar als constante herhaling nodig is dan heeft duidelijk de veel kortere term’ unit ‘ zijn aantrekkingskracht.
Wat is ‘enzymactiviteit’
activiteit wordt uitgedrukt in eenheden per ml (E / ml), met andere woorden nmol per min per ml (indien eenheidsdefinitie B is aangenomen). De in eenheden uitgedrukte activiteitswaarden zijn dus ook onderhevig aan een illusoire 1000-voudige ’toename’ als men van eenheidsdefinitie A overschakelt naar eenheidsdefinitie B. Ook hier kan geen verwarring ontstaan als de activiteit wordt uitgedrukt in nmol per min per ml in plaats van in eenheden per ml.
aangezien de activiteit betrekking heeft op de concentratie, kunnen twee injectieflacons met enzym hetzelfde aantal eenheden (in totaal) bevatten, maar verschillende activiteiten (concentraties) hebben.
Wat is specifieke enzymactiviteit?
specifieke enzymactiviteit (meestal gewoon “specifieke activiteit” genoemd) is het aantal enzymeenheden per ml gedeeld door de eiwitconcentratie in mg/ml. Specifieke activiteitswaarden worden daarom vermeld als eenheden / mg of nmol / min / mg (indien eenheidsdefinitie B wordt toegepast).
specifieke activiteit is een belangrijke maatstaf voor enzymzuiverheid en de waarden voor verschillende partijen van een zuiver enzym moeten binnen een normale experimentele fout hetzelfde zijn.
seriële verdunningen van een enzymoplossing hebben verschillende enzymactiviteitswaarden, maar identieke specifieke activiteitswaarden omdat bij de berekening van de specifieke activiteit de teller (eenheden/ml) en de noemer (mg/ml) gelijkelijk worden beïnvloed door monsterverdunning.
hoewel specifieke activiteit sterk verschilt van activiteit, is de berekening van specifieke activiteit toch afhankelijk van de activiteitswaarde, en daarom zal de vermelde specifieke activiteitswaarde ook afhankelijk zijn van de definitie van de enzymeenheid. Partijen die onder de verwachte specifieke activiteitswaarde liggen, kunnen onzuiverheden of enzymmoleculen bevatten die gedenatureerd zijn geworden.
factoren die de enzymactiviteit beïnvloeden
In deze sectie bespreken we waarom een enzym verschillende gemeten activiteitswaarden kan hebben in verschillende laboratoria. Hiermee bedoelen we reële verschillen in gemeten activiteit, niet schijnbare verschillen veroorzaakt door het gebruik van verschillende eenheidsdefinities.
de omstandigheden waaronder een test wordt uitgevoerd zullen de gerapporteerde activiteitswaarden beïnvloeden. In het algemeen zal een enzym bij 37°C actiever zijn dan bij 20°C.
de definitie van de enzymeenheid zou beter zo worden uitgedrukt:
1 eenheid (U) is de hoeveelheid als enzym die de reactie van 1 nmol substraat per minuut onder standaardomstandigheden katalyseert.
helaas staat de term ‘standaardvoorwaarden’ open voor interpretatie en kunnen er verschillende gebruikersvoorkeuren zijn, tenminste in R&D omgevingen. Zo kunnen tien verschillende onderzoekslaboratoria (vrij correct) verschillende activiteiten voor dezelfde oplossing van enzym berekenen. De meeste onderzoekslaboratoria stellen hun eigen ‘standaardvoorwaarden’ vast en controleren elke nieuwe batch intern. In klinische omgevingen worden’ standaardvoorwaarden ‘ expliciet gedefinieerd en moeten alle laboratoria identieke tests uitvoeren.
ontwikkeling van Assays en het belang van lineair bereik
De activiteitswaarde (eenheden/ml) voor uw enzym is de belangrijkste parameter wanneer u een assay ontwikkelt. Dit komt omdat het volume (dat wil zeggen het aantal eenheden) dat u toevoegt, de hoeveelheid substraat bepaalt die wordt omgezet in product. Onthoud dat 1 eenheid de omzetting van 1 nmol substraat per min katalyseert (definitie B).
de gerapporteerde eenheden / ml kunnen u een globaal idee geven van de hoeveelheid enzym die u moet toevoegen, maar aangezien de activiteitswaarde mogelijk niet is bepaald in een test die identiek is aan die van u, is het gebruikelijk om seriële verdunningen van het enzym te bereiden (bijvoorbeeld log verdunningen in eerste instantie) en om een vast volume van elke verdunning te testen. Afhankelijk van het analysesignaal (dat gerelateerd zal zijn aan de hoeveelheid geconverteerd substraat) kan een tweede experiment nodig zijn om een geschikte verdunning te ondergaan.
Wat is precies de’ beste ‘ verdunning? Om dit te beantwoorden, moeten we nadenken over het belangrijkste aspect van assay design – lineair bereik. Het is belangrijk voor kwantitatief werk om in een waaier te werken waarin een grafiek van analysesignaal (vaak absorptie) versus enzymconcentratie lineair is. De meeste analyses zijn lineair als de mate van substraatconversie minder dan 15% is, ervan uitgaande dat er geen andere beperkende factoren zijn. Door de assay tijd (b.v. 30 min) en temperatuur (b. v. 25oC) vast te stellen kan de mate van conversie eenvoudig worden geregeld door één parameter aan te passen, namelijk het aantal toegevoegde enzymeenheden.
Dit wordt grafisch geïllustreerd in Figuur 1 met verdunningen uitgedrukt als reciprociteit (d.w.z. verdunning van 1/10 = 0,1 op de x-as). Uw eigen plot kan verschillen in vorm en lineair bereik, maar bij een zeer hoge enzymconcentratie zal het analysesignaal ongetwijfeld niet toenemen in verhouding tot de hoeveelheid toegevoegd enzym.
de assay in Figuur 1 is lineair tot optische dichtheid (od) 2,5 en een verdunningsfactor van 0,02 (1/50 verdunning van het enzym) zou ideaal zijn voor assay werk, omdat het een groot signaal (~1,5) geeft en ligt in het midden van het lineaire bereik. Berekeningen op basis van resultaten voor verdunningsfactoren in het bereik tussen 0,04 en 0,12 (d.w.z. het gebied met verminderde helling) zullen het werkelijke niveau van enzymactiviteit onderschatten omdat iets duidelijk de grootte van het analysesignaal beperkt.
vele factoren kunnen werken om het lineaire bereik te beperken en het bereik zal variëren van assay tot assay. Een veel voorkomende reden voor niet-lineariteit is overmatig gebruik van substraat, waardoor de reactiesnelheid kan dalen, maar beperkingen van de optische componenten van de plaatlezer (of welk meetapparaat dan ook wordt gebruikt) kunnen ook significant zijn. De meeste plaatlezers kunnen bijvoorbeeld de absorptiewaarden boven 3 niet betrouwbaar meten en deze beperking geldt ongeacht het percentage van het substraat dat in product is omgezet.
Fig 1. Absorptie Versus hoeveelheid enzym
hoewel niet anders besproken in deze gids, dient men zich er ook van bewust te zijn dat enzymen na verloop van tijd kunnen denatureren, vooral als ze zeer verdund zijn, en de producten van sommige reacties het enzym kunnen remmen. Er zijn inderdaad andere mogelijke redenen voor niet-lineair gedrag, maar het is meestal relatief gemakkelijk om het lineaire bereik te vinden door trial and error met behulp van seriële verdunningen van het enzym zoals hierboven beschreven.
Assay tijd en temperatuur
deze parameters kunnen ook Het lineaire bereik beïnvloeden omdat ze de snelheid van substraatconversie beïnvloeden. Bijvoorbeeld, kan een analyse lineair zijn na 15 min, maar bij 60 minuten kan te veel substraat zijn verbruikt. In deze situatie zou u de hoeveelheid enzym moeten verminderen om uw assay gedurende 60 minuten uit te voeren. De zelfde overwegingen zijn op testtemperatuur van toepassing aangezien het het tarief van reactie ook kan beà nvloeden.
De meeste mensen nemen een assay tijd van ergens tussen 15 min en 60 min. Zeer korte tijden (b. v. 2 min) moeten worden vermeden omdat een kleine vertraging bij het stoppen van de reactie tot een significante fout in de berekeningen van de activiteit leidt. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat reagentia die in een koelkast of diepvriezer worden opgeslagen voor gebruik op de juiste temperatuur zijn geëquilibreerd, en dit is vooral belangrijk als u een relatief korte testtijd hebt.
volume / gevoeligheid
in de praktijk wordt het volume bepaald/beperkt door het verbruiksartikel dat u voor uw tests gebruikt (bijvoorbeeld cuvetten, buizen of microplaten). Het signaal voor de meeste enzymanalyses is evenredig met het volume van de analyse en pogingen om de analyse te miniaturiseren (bijvoorbeeld om reagentia te conserveren) zullen meestal leiden tot lagere signalen. Absorptieanalyses zijn echter vaak een uitzondering, en een overstap van een 3ml cuvette naar 1ml microcuvette, bijvoorbeeld, zal de absorptiewaarde niet veranderen als de breedte (padlengte) van de cuvette nog steeds 1 cm is (d.w.z. het licht gaat nog steeds door dezelfde ‘lengte’ van vloeistof). Dit komt omdat de absorptie evenredig is aan de lengte van het pad, niet aan het volume van het monster.
bij absorptietests met microplaten is de weglengte gelijk aan de diepte van de vloeistof en is het mogelijk om zonder signaalverlies te miniaturiseren door de diameter van de putjes te verminderen en een constante vloeistofdiepte te handhaven. Bijvoorbeeld, kunnen 96 goed platen gemakkelijk 200ul van steekproef aanpassen, maar met een 50ul assayvolume zou het beter zijn om een 384-goed plaat te gebruiken om de weglengte over te verhogen die met 50ul van steekproef in een 96 – goed plaat wordt gezien.
continue Assays (het Productverschijnsel in de tijd meten)
De meeste assays worden uitgevoerd voor een vaste periode (eindpuntbepalingen) en de reactie wordt gestopt door toevoeging van een stopreagens (bv. zuur). Echter, in continue assays het uiterlijk van het product (minder vaak het verbruik van substraat) wordt continu geregistreerd (bijv. door middel van een kaartrecorder). Dezelfde basisregels zijn van toepassing; een plot van signaal versus tijd voor een vaste hoeveelheid enzym moet lineair zijn en de snelheid moet verdubbelen als de hoeveelheid enzym wordt verdubbeld. Zolang de test in het lineaire bereik wordt uitgevoerd, kan de activiteit van op passende wijze verdunde “onbekenden” nauwkeurig worden bepaald aan de hand van de initiële reactiesnelheden die met een reeks normen worden gemeten.
welke Substraatconcentratie moet ik gebruiken?
de concentratie van het substraat zal de reactiesnelheid beïnvloeden, maar er zijn verschillende factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het selecteren van de ‘juiste’ concentratie. Vanuit praktisch oogpunt is een belangrijke overweging de hoeveelheid product die moet worden gegenereerd om een meetbaar assay signaal te geven. Aangezien de snelheid van een enzymreactie waarschijnlijk zal dalen wanneer meer dan ongeveer 15% van het substraat is gehydrolyseerd, moet de initiële concentratie van het substraat over het algemeen ten minste 10x de concentratie van het product zijn waarvan bekend is dat het een aanvaardbaar analysesignaal geeft.
een andere overweging is de Km voor het substraat. Terwijl het toevoegen van meer substraat in het algemeen betekent dat u hogere activiteitswaarden te zien, de relatie is niet lineair en de kosten van het substraat moet mogelijk worden overwogen. Op dit punt is het waarschijnlijk nuttig om de klassieke vergelijking Michaelis-Menten te introduceren:
v = (Vmax S)/(Km + S) ……………. Eqn. (1)
waarbij v De snelheid is, Vmax de maximaal mogelijke snelheid, S de substraatconcentratie en Km is gelijk aan de substraatconcentratie die de helft van de maximale activiteit geeft. De afleiding van deze vergelijking en de onderliggende veronderstellingen kan worden gevonden in een tekstboek over enzymkinetiek. Hoewel het normaal is om eerder te meten dan om het tarief van enzymreacties te berekenen, is het nuttig om de onderliggende principes voor het doel van assayontwerp te begrijpen.
De vergelijking Michaelis-Menten is nuttig omdat het U helpt een geschikte substraatconcentratie te selecteren als De Km bekend is.
wanneer S = Km, v =(Vmax S)/2S, d.w.z. v/Vmax = s / 2S = ½.
met andere woorden, het enzym werkt met 50% van de maximaal mogelijke snelheid wanneer S=Km.
door in vergelijking 1 de waarden voor s = 10 en Km = 1 te vervangen, zult u zien dat door de substraatconcentratie 10-voudig te verhogen, het enzym nu werkt op ~90% van het maximaal mogelijke tarief, in plaats van 50%. Dit is duidelijk hoger, maar niet 10 keer hoger.
bij zeer hoge substraatconcentraties wordt de Km in vergelijking 1 Numeriek onbeduidend en is de gemeten snelheid dan gelijk aan Vmax.
veel tests worden uitgevoerd met substraatconcentratie bij of rond de Km-waarde, maar als De Km zeer hoog is, is het mogelijk dat een dergelijke hoge substraatconcentratie niet kan worden gebruikt (bv. om redenen van kosten of beperkte oplosbaarheid).
in sommige situaties kan het zelfs raadzaam zijn om een relatief lage substraatconcentratie te gebruiken. Bijvoorbeeld, in farmaceutische drugontdekking, zou het gebruik van een zeer hoge substraatconcentraties het moeilijker maken om concurrerende enzymremmers te identificeren (concurrerende inhibitors binden aan dezelfde plaats als het substraat).
een evenwicht tussen de verschillende factoren moet worden gevonden, zodat de test een meetbaar signaal heeft, in het lineaire bereik kan worden gebruikt en aan alle andere testdoelstellingen kan voldoen (bv. kosten, tijd, enzovoort).
Standaardcurves
een standaardcurve is altijd nodig als u de enzymactiviteit wilt berekenen. Het is niet essentieel als u alleen geïnteresseerd bent in relatieve activiteitswaarden.
De standaardkromme wordt geconstrueerd door het analysesignaal te meten met standaardoplossingen van het reactieproduct over een geschikt concentratiebereik. Idealiter zou u een standaardcurve voor elk experiment moeten uitvoeren, maar als de standaardcurve zeer reproduceerbaar is, kan het aanvaardbaar zijn om deze periodiek uit te voeren.
een typische standaardcurve is weergegeven in Figuur 2 hieronder. Dit is een standaardkromme voor een atpaseanalyse, waarin ATP aan ADP en Pi (anorganisch fosfaat) wordt gehydrolyseerd.
Fig 2. Standaardkromme voor Pi
het fosfaat wordt gedetecteerd door middel van een kleurstofbindingsreagens dat van kleur verandert in aanwezigheid van fosfaat. De bijzonderheden van deze test zijn hier echter niet van belang; ongeacht de aard van het product of de gebruikte detectiemethode moet een standaardkromme worden geconstrueerd waaruit blijkt dat het signaal afhankelijk is van de hoeveelheid product in de test. De “kromme” (idealiter een rechte lijn) wordt gebruikt om de hoeveelheid product te bepalen die wordt gegenereerd in monsters met onbekende activiteit, d.w.z. uit de absorptiewaarde, door het snijpunt op de x – as af te lezen. (De meeste grafische softwarepakketten berekenen automatisch waarden van x uit gemeten waarden van y). De hoeveelheid activiteit kan dan worden berekend (zie later).
zet ik concentratie of Absolute hoeveelheid op de x-as uit?
er is hier geen enkel correct antwoord, en de mogelijkheid om beide benaderingen te gebruiken kan vaak tot verwarring leiden wanneer activiteitswaarden worden berekend. Bijvoorbeeld, plotten nmol van het product op de x-as is erg handig als je nodig hebt om activiteitswaarden te berekenen (vergeet niet, activiteit = nmol per min per ml). Nochtans, worden laboratoriumreagentia gewoonlijk bereid in bekende concentraties, en het is vaak gemakkelijker om deze waarden op de x-as te plotten. Wanneer u echter de activiteit (of specifieke activiteit) van uw enzym berekent, moet u eraan denken de concentratie op de x-as om te zetten in het aantal gevormde nmolen van het product, wat betekent dat u rekening moet houden met het volume van de assay. De reden is gemakkelijk te begrijpen: 50ul en 100ul volumes van een standaardoplossing zullen in dezelfde concentratie zijn, maar het grotere volume zal tweemaal de hoeveelheid product bevatten. In het algemeen is het het beste om één benadering te kiezen (d.w.z. ofwel de absolute hoeveelheid product of concentratie uit te zetten), zodat altijd dezelfde methode voor het berekenen van de activiteit wordt gebruikt.
controles en aftrekken van “Blanco” gegevens
goede controles zijn van vitaal belang voor kwantitatief werk, evenals het juiste gebruik van de controlegegevens in berekeningen.
controles vertellen u (indirect) hoeveel van het analysesignaal te wijten is aan de werking van het enzym en hoeveel er om andere redenen ontstaat. Een veel voorkomende bron van’ vals ‘ signaal is het substraat (dat vaak besmet kan zijn met product). Andere assaycomponenten kunnen ook leiden tot een klein signaal afhankelijk van de aard van de componenten en het type assay. Het doel van controles is om u in staat te stellen om alle elementen van het totale signaal te verwijderen (door af te trekken) die niet gerelateerd zijn aan de werking van het enzym. Als de test goed is ontworpen en de testreagentia van goede kwaliteit zijn, is de behandeling van controles meestal vrij eenvoudig.
hieronder worden enkele algemene richtlijnen gegeven:
als we terugkeren naar de colorimetrische test voor het detecteren van anorganisch fosfaat, kunnen we enkele potentiële problemen aan het licht brengen die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd met de juiste controles.
het fosfaatdetectie-reagens geeft een lage aflezing van ongeveer 0,08 in een 96-wells-plaat bij de golflengte die wordt gebruikt voor de meting (ongeveer 650nm).
We kunnen de volgende assays/controles instellen (metingen tussen haakjes in een hypothetische assay situatie):
- alle assay componenten minus enzym (0,5)
- enzym op zichzelf (0.1)
- enzym plus alle andere componenten (1.8)
het signaal van de assay van 1.8 is duidelijk niet alleen te wijten aan de werking van het enzym op het substraat.
voor elke enzymtest is een belangrijke controle (A) het weglaten van het enzym (en vervangen door buffer). Dit geeft u het achtergrondsignaal voor alle andere assaycomponenten als groep, met inbegrip van het substraat dat een kleine hoeveelheid product kan bevatten. Deze controle geeft u niet het Achtergrond signaal voor het enzym, maar het is duidelijk dat u het enzym niet kunt toevoegen aan het substraat als een controle! In de meeste analyses geeft het enzym geen signaal omdat het beduidend vóór gebruik in analyse wordt verdund. Dit kan eenvoudig worden gecontroleerd, zoals in B hierboven.
de gegevens voor monster A (hierboven) wijzen erop dat het mengsel verontreinigd is met anorganisch fosfaat. De afzonderlijke componenten kunnen vervolgens worden gecontroleerd om de bron van het probleem te identificeren. Deze situatie is vrij gemeenschappelijk voor analyses van ATPases en andere fosfaat – genererende enzymen, aangezien de substraten vaak onstabiel zijn en gedeeltelijk gehydrolyseerd om wat anorganisch fosfaat te geven.
Het kan lastig zijn om ruwe gegevens te corrigeren als verschillende componenten valse signalen geven; eliminatie van het probleem aan de bron is over het algemeen veel beter dan een wiskundige behandeling. De’ gecorrigeerde ‘ waarde voor monster C kan 1,2 (d.w.z. 1.8 – 0.5 – 0.1) maar strikt genomen is dit verkeerd. Vergeet niet dat de testplaat plus detectiereagens een achtergrondsignaal van rond 0,08 geven, zodat is de bron van het grootste deel van het signaal voor controle A het plastic van de plaat en/of het detectiereagens. Hetzelfde kleine signaal moet ook worden verborgen binnen de waarde voor de enzymcontrole. Dus in de bovenstaande correctie hebben we deze verborgen blanco twee keer afgetrokken.
u zult altijd controles van de testgegevens moeten aftrekken, en het verdient de voorkeur om alle stoffen (behalve enzym) te combineren en één enkele waarde af te trekken. Als deze benadering wordt gevolgd, wordt de standaardkromme op dezelfde wijze behandeld en wordt een controlewaarde afgetrokken (d.w.z. de waarde die bij afwezigheid van het product wordt verkregen, d.w.z. analoog aan de hierboven besproken plaat/reagens-blanco). Aldus bevat noch de afgetrokken testgegevens, noch de afgetrokken standaardkromme het potentieel misleidende achtergrondsignaal dat door het Plaat/testreagens wordt veroorzaakt.
ten slotte, zoals we hebben gezien, worden valse signalen gemakkelijk gedetecteerd met de juiste controles, maar de beste strategie om gegevens van goede kwaliteit te verkrijgen is het gebruik van reagentia met lage achtergronden, zodat de controlewaarden laag zijn. Het is ook nuttig om een analysesignaal (wegens enzym) te produceren dat veel hoger is dan om het even welk achtergrondsignaal. Idealiter zou de signaal-achtergrondverhouding ten minste 5 en bij voorkeur 10 of meer moeten zijn voor nauwkeurig kwantitatief werk.
het berekenen van Activiteitswaarden
Dit is vrij gemakkelijk te begrijpen als we stapsgewijs back-berekenen uit ruwe assaygegevens. Bijvoorbeeld, laten we zeggen dat we hebben gegenereerd 10nmol van product in onze enzymreactie (dat wil zeggen bepaald uit de standaard curve van signaal versus absolute hoeveelheid product). Aangezien de activiteit wordt uitgedrukt als nmol per min per ml, moeten we rekening houden met tijd en volume en, misschien minder duidelijk, de hoeveelheid en verdunning van het enzym om de activiteit te berekenen.
als de test 10 minuten lang is, is het aantal nmol per min in het bovenstaande voorbeeld 1. (step1)
als het volume van de bepaling 200ul is, moeten we vermenigvuldigen met 5 (d.w.z. 1000/200) om nmol per min per ml te krijgen. (stap 2)
deze waarde heeft betrekking op de activiteit van het enzym in de assay, niet in het monster van het enzym dat is gebruikt om de assay op te zetten. Enkele verdere correctiefactoren zijn nodig om de enzymactiviteit in het oorspronkelijke monster van enzym te bepalen.
het enzym kan vóór gebruik zijn verdund en moet verder worden verdund door de andere bestanddelen in de test. Als de test (200ul in totaal) 20ul enzym bevat, en het enzym is vooraf verdund 1/100 voordat het 20ul monster wordt toegevoegd, kunt u waarschijnlijk zien dat we eerst moeten vermenigvuldigen met 10 (Stap 3) en vervolgens met 100 (stap 4) om de activiteit van het enzym in de oorspronkelijke enzymoplossing te krijgen.
tot nu toe is dit relatief eenvoudig. We hebben echter al eerder gezegd dat de concentratie vaak wordt uitgezet op de x-as van de standaardkromme. Zo kunnen de waarden worden uitgedrukt in mM termen (niet mmol) en je kunt het aantal mmol niet bepalen door simpelweg de standaard curve te inspecteren.
aangezien mM mmolen per liter betekent, hebben we een discrepantie tussen het impliciete volume van 1L en het werkelijke volume van de bepaling. Aldus als wij 10mm product hebben en het analysevolume 200ul is, moeten wij door 5000 delen om het aantal mmolen van product te krijgen.
u kunt hier merken dat delen door 5000 hier een aantal van de vermenigvuldiging operaties die hierboven werden vereist compenseert. Het is inderdaad heel normaal dat correctiefactoren teniet worden gedaan. Bijvoorbeeld, in een 10 minutenanalyse met behulp van 1/10 verdund enzym, zal u door 10 delen om nmol per min te krijgen en later met 10 vermenigvuldigen om voor de verdunningsfactor te corrigeren.
Hieruit volgt dat als u altijd standaard assay voorwaarden (d.w.z. uw standaard), zult u in staat zijn om de ‘x’ – waarde van de standaardcurve te vermenigvuldigen met een enkele globale correctiefactor, die alle andere individuele correctiefactoren omvat, om uw activiteitswaarden te berekenen. Alleen bij de eerste gelegenheid moet u de individuele correctiefactoren identificeren.
Enzyminhibitie/Drugscreening
Dit is een gebied van de enzymologie waar het nog steeds nodig is om in het lineaire bereik te werken, maar waar berekeningen van activiteitswaarden gewoonlijk niet relevant zijn; in plaats daarvan is de relatieve reactiesnelheid (of de relatieve hoeveelheid gevormd product) in aanwezigheid en afwezigheid van een teststof essentieel, wat weinig meer vereist dan eenvoudige berekeningen met behulp van de blanco – afgetrokken assaygegevens. Na aftrekking van de blanco ‘ s wordt de hoeveelheid gevormd product uitgedrukt als een percentage van de hoeveelheid die zonder de teststof wordt verkregen (d.w.z. 100%). Deze tests kunnen soms worden uitgevoerd met vrij lage signaal-achtergrond ratio ‘ s, omdat de vraag wordt gesteld: remt de teststof de reactie?
– vereist alleen een ja / nee antwoord.
samenvatting
Deze gids heeft hopelijk duidelijke verklaringen gegeven voor “enzymeenheden”, “enzymactiviteit” en “Specifieke enzymactiviteit”, en eenheidsdefinities en het belang van het “lineaire bereik”. De details van wat te plotten op de x-as van standaard curves is een kwestie van de voorkeur van de gebruiker, maar enige zorg is vereist wanneer activiteiten worden berekend. Assay controles zijn belangrijk, maar het gebruik van hoogwaardige reagentia is beter dan het verwijderen van achtergronden met behulp van wiskundige benaderingen. Een hoge signaal-achtergrondverhouding is wenselijk voor kwantitatief werk en een aantal parameters kunnen worden gevarieerd om het analysesignaal te verhogen; het is niet altijd nodig om eenvoudig meer enzym toe te voegen. De waarden van de enzymactiviteit kunnen gemakkelijk worden berekend als een stapsgewijze benadering wordt gebruikt om de belangrijkste assayvariabelen te identificeren.
Zie meer protocollen en gidsen