uw adviseur vertelt u dat hij wil dat u HPLC Gebruikt om uw verbinding te analyseren. Je weet dat je al eerder van deze techniek hebt gehoord, maar je kunt je niet herinneren waar HPLC voor staat, laat staan hoe je het moet doen! We zijn er allemaal geweest, en ik wed dat je wou dat je meer aandacht had besteed in die lezing!
Vrees niet-in deze serie artikelen zal ik u herinneren aan de kracht van de HPLC-kolom 🙂
in dit eerste artikel zal ik u door het principe van HPLC leiden en u herinneren aan het gebruik ervan-U bent in een mum van tijd klaar voor het lab!
Hoe werkt HPLC?
hogedrukvloeistofchromatografie, of HPLC, is een lange naam voor een krachtige techniek gebaseerd op het simpele feit dat individuele verbindingen zich anders gedragen in water.
HPLC scheidt en zuivert verbindingen volgens hun polariteit of hun neiging om water leuk of niet leuk te vinden. Om polariteit in context te plaatsen, bedenk dan dat olie een apolaire vloeistof is die niet met water vermengt. Ethanol, aan de andere kant, is polair en zoals velen van jullie weten, mengt zeer goed met water (wodka en Cola iemand??).
Ik heb geprobeerd om het hele proces te vereenvoudigen in Figuur 1 hieronder, maar laten we eerst kijken naar de belangrijkste componenten die betrokken zijn bij HPLC. Excuses bij voorbaat voor wat onvermijdelijk jargon!
de componenten
de HPLC-kolom
Dit is ook bekend als de stationaire fase. Dit is het werkpaard van de HPLC-machine, is gemaakt van een verscheidenheid aan stoffen (vaak silica) en is zeer compact van aard. De kiezeldeeltjes worden gefunctionaliseerd door lange koolstofketens. De koolstofketens zijn apolair en dus hoe langer de ketting, hoe apolair de kolom wordt. Kolommen met 18-koolstofketens worden vaak gebruikt en staan bekend als C18-kolommen.
het HPLC-Monster
type Monster varieert sterk, afhankelijk van het veld en het type verbindingen in kwestie. HPLC kan worden gebruikt om samenstellingen in biologische specimens (urine, bloed, speeksel, en spier), milieusteekproeven, geneeskrachtige chemie (drugs), en microbiologie (toxines die door schimmels en bacteriën worden geproduceerd) te analyseren.
injectie van monster
monsters worden in de HPLC-kolom geïnjecteerd. Dit werd vroeger handmatig uitgevoerd, wat betekent dat een arme ziel uren achtereen bij de HPLC-machine moest zitten en elk monster met een spuit moest injecteren, soms de hele nacht lang!
gelukkig hebben nieuwere modellen een automatische injector, waardoor de handmatige invoer wordt verminderd en een hogere doorvoer mogelijk is. Moderne machines zijn uitgerust met software waarmee de gebruiker een lijst van monsters kan invoeren, hoeveel en in welke volgorde ze moeten worden geïnjecteerd. Zo kunt u genieten van uw lunch terwijl uw HPLC zelf loopt!
de mobiele fase
Dit is eigenlijk gewoon een mengsel van water en een organisch oplosmiddel (meestal acetonitril of methanol). De mobiele fase krijgt zijn naam omdat het door de kolom beweegt en tegelijkertijd de verbindingen uit de kolom eluleert (of wegspoelt).
verbindingen worden vaak geëlueerd langs een concentratiegradiënt. Als je op mij lijkt, zijn concentratie en gradiënt twee woorden die je niet graag samen ziet komen in een zin! Het betekent alleen dat het percentage water in de mobiele fase in de tijd afneemt, terwijl het percentage van het apolaire oplosmiddel tegelijkertijd toeneemt. Dit betekent dat de mobiele fase geleidelijk apolair wordt. Maak je voorlopig niet te veel zorgen over gradiënten, want ze zullen weer verschijnen in een vervolgartikel.
de HPLC-run
HPLC kan in een aantal modi worden uitgevoerd. De meest gebruikte methode staat bekend als reversed-phase (RP-HPLC) en dit is wat ik hier beschrijf. In deze modus, worden samenstellingen gescheiden beginnend met de meest polaire, en eindigend met de apolaire samenstellingen. Voor alle modi beweegt een krachtige pomp het monster en de mobiele fase door de kolom. Een typische run kan tussen de 10-60 minuten duren.
het principe achter HPLC-een kijkje
nu je een idee hebt van de betrokken componenten, laten we verder gaan met het principe in een beetje meer detail.
Ik heb hierboven vermeld dat HPLC verbindingen scheidt op basis van polariteit. Maar hoe werkt dit eigenlijk? Engels alsjeblieft! Als de gradiënt begint, neemt de oplosmiddelconcentratie toe terwijl de waterconcentratie afneemt. Dit maakt de mobiele fase meer en meer apolair. De verbindingen in het monster zullen aan de koolstofketens in de kolom kleven, waarbij de meeste apolaire verbindingen het sterkst kleven en de meeste polaire verbindingen zwak kleven.
figuur 1 laat zien wat er gebeurt met een monster dat een mengsel van verbindingen bevat na injectie in de kolom. De samenstellingen binden aan de kolom en worden uitgespoeld op verschillende tijden, afhankelijk van of zij waarschijnlijker aan de kolom of de mobiele fase zullen plakken aangezien het door wordt gepompt. De tijd dat elke samenstelling elutes (of spoelt uit) van de kolom is genoemd geworden de behoudtijd van die samenstelling (Rf).
figuur 1: het principe achter HPLC
figuur 1: verbindingen met verschillende polariteiten (aangeduid als donkerder tinten blauw) worden in de HPLC-kolom (volledige cilinder) geïnjecteerd. De mobiele fase wordt gepompt door de kolom, en de toevoeging van oplosmiddel langs een concentratiegradiënt (weergegeven als een zwarte gestippelde lijn) vermindert continu de totale polariteit van de mobiele fase (Y-as). De samenstellingen kunnen aan of de kolom of de mobiele fase plakken, afhankelijk van hoe polair zij zijn. Verbindingen zullen uiteindelijk vasthouden aan de mobiele fase wanneer hun polariteit overeenkomt met die van de mobiele fase. Ze zullen zich dan loskoppelen van de kolom en zullen op een bepaald moment (X-as) tijdens de run worden ontsleuteld. Deze keer staat bekend als de Rf voor die verbinding.
inzicht in de output
De output of resultaten van een HPLC-run wordt meestal gezien als een chromatogram (Figuur 2). Dit is een horizontale reeks pieken die samenstellingen voorstellen die uit de kolom met verschillende RF-waarden worden geëlueerd. Het moderne HPLC-materiaal wordt vaak gekoppeld aan een de detector van de diode array (DAD), toestaand de gebruiker om het resulterende chromatogram van gescheiden samenstellingen in golflengten van 190 nm aan 900 nm te bekijken. Als de onderzochte verbindingen bekend zijn, kan de gebruiker kiezen om slechts naar 1 of een paar geselecteerde golflengten te kijken. Cocaïne kan bijvoorbeeld worden waargenomen bij 254 nm.
Figuur 2: een typisch HPLC-chromatogram
Figuur 2: Dit chromatogram toont de scheiding van verbindingen van een chemische reactie en het chromatogram wordt bekeken bij 254 nm. Twee belangrijke pieken komen bij 8,20 en 9 minuten voor, die twee samenstellingen met deze retentietijden vertegenwoordigen. Het aantal absorptieeenheden (ae) wordt op de Y-as weergegeven, terwijl de tijd van de run op de X-as wordt weergegeven.
toepassingen
binnen de biologie en de geneeskunde wordt HPLC vaak gebruikt als analytisch instrument om biologische en milieumonsters te bepalen op de aanwezigheid of afwezigheid van bekende verbindingen (bijvoorbeeld metabolieten, geneesmiddelen, toxinen, pesticiden), en kan het helpen bij de identificatie van onbekende verbindingen.
binnen de chemie wordt HPLC echter routinematig gebruikt om chemische reacties te controleren en om de zuiverheid van de producten te bepalen. Bovendien kan het proces van HPLC aan preparative HPLC worden gewijzigd, waarbij de samenstellingen van belang voor verder gebruik kunnen worden gezuiverd.
HPLC kan in het begin erg ingewikkeld overkomen, maar wees gerust, net als de meeste andere labtechnieken, is het veel logischer als je het echt doet.
Stay tuned voor mijn follow-up artikelen in de komende weken, waarin Ik zal gaan door middel van een aantal tips over hoe u het beste uit uw HPLC run afhankelijk van uw onderzoeksdoel, evenals objectief bespreken hoe HPLC kan worden gebruikt binnen uw onderzoek.
zijn er nog andere aspecten van deze techniek die u meer in detail wilt behandelen? Als dat zo is, horen we graag van u!
Happy HPLC-ing 🙂
heeft dit u geholpen? Dan kunt u delen met uw netwerk.