Identificatie van Bordetella pertussis in een met kritiek ziek humaan immunodeficiëntievirus geïnfecteerde patiënt door directe genotypische analyse van Gramkleurig materiaal en discriminatie van B. holmesii door gebruik te maken van een unieke Reca-Genrestrictie-Enzymplaats

de identificatie van bacteriën uit klinische specimens gebeurt grotendeels via fenotypische karakterisatie na in vitro kweek en microscopie. Niet zelden, echter, directe gram-bevlekte preparaten onthullen veel organismen, maar culturen niet om een ziekteverwekker aan te tonen. Dit werd geïllustreerd in een recent klinisch geval, waarin een 48-jarige man met AIDS werd opgenomen met pulmonale coccidioidomycose. Ondanks schimmeldodende therapie, zijn status niet te verbeteren. Sputumsteekproeven onthulden vele gram-negatieve bacillen op directe microscopie maar geen ziekteverwekkers op cultuur. Bovendien, verscheidene bloedculturen groeiden veeleisende gram-negatieve staven, die niet konden worden speciated door conventionele methoden.

we besloten om te proberen de twee isolaten te identificeren door middel van genotypische methoden met behulp van universele oligonucleotide primers gericht op de kleine subeenheid rRNA (16S rRNA) gen. Van de respiratoire monsters waren echter alleen Gramkleurige objectglaasjes beschikbaar. Daarom hebben we een nieuwe methode ontwikkeld, waarbij bacterieel DNA direct uit de Gramkleurige dia wordt teruggewonnen. De objectglaasjes zijn Gram gekleurd volgens de traditionele methode (12). Een helder glazen dia werd besmeurd met monsters en behandeld met absolute methanol (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), gevolgd door warmtefixatie bij 65°C en behandeling met kristalviolet-oplossing (Remel, Lenexa, Kans.). De dia werd verder behandeld met Gram jodium (Remel), ontkleurd met alcohol-aceton oplossing (3:1), en tegenbehandeld met safranine (Remel). De onderdompelings-olie werd eerst met 100% xyleen (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) van de dia verwijderd, gevolgd door het spoelen in 100% ethanol. Vervolgens werd het materiaal gesloopt met een recht scheermesje, gesuspendeerd in 50 µl Puregene-DNA-hydratatieoplossing (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexed, en gekookt voor 10 min. Voor de analyse van het bloedisolaat werd materiaal gebruikt van zowel de bacteec-fles als van kolonies die op vast medium werden gekweekt. Daaropvolgend werd PCR uitgevoerd in een volume van 50 µl dat 5 µl van de template bevatte, 1,5 mM MgCl2, 100 µM elk deoxynucleoside trifosfaat (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 u van Taq DNA-polymerase (Roche Diagnostics Corporation), en 0,15 µM (elk) universal 16S rRNA primers 11E (5′-GAGGAAGGGGGATGACG-3′) en 13B (5′-TCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′) zoals eerder beschreven (15). Na een denaturatiestap van 5 min bij 94°C werden PCR-stappen van 94°C voor 60 s, 50°C voor 60 s en 72°C voor 90 s 30 keer herhaald in een Perkin-Elmer GeneAmp PCR-systeem 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Produkten werden verkregen uit zowel sputum als bloed (Fig. 1). Deze werden gezuiverd met de QIAQUICK PCR zuiveringskit (Qiagen Inc. Valencia, Calif.), en DNA-sequencing werd uitgevoerd op een toegepaste Biosystems ABI3100 sequencer (HHMI Biopolymer/W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School Of Medicine). Een latere vergelijking met de openbare database (GenBank) door BLAST (1) identificeerde het bloedisolaat als Helicobacter cinaedi of Helicobacter rappini. Beide organismen zijn in verband gebracht met bacteremieën bij immuungecompromitteerde patiënten (9, 10, 13, 16, 17). Het PCR-product van het respiratoir isolaat kwam overeen met de 16S rRNA-genen van zowel Bordetella pertussis als Bordetella holmesii, die 99,5% homoloog en identiek zijn in het versterkte gebied (18).

om het respiratoire isolaat Bordetella te specialiseren en het resultaat van de genotypische analyse te valideren, werd een discriminerende test ontwikkeld waarbij een deel van het recA-Gen (6, 7), dat een unieke plaats van het restrictie-enzym bevat, werd onderzocht. Amplification of B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) en B. HOLMESII (ATCC 51541) DNA evenals dat van het sputum Gram van onze patiënt kleuring werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven, behalve dat 3 mM MgCl2 en nieuw ontworpen specifieke primers (forward, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; de PCR-stappen (94°C voor 30 s, 59°C voor 30 s, en 72°C voor 60 s) werden 45 keer herhaald, gevolgd door een laatste rek bij 72°C. De producten werden verteerd met NciI volgens de aanbevelingen van de fabrikant (New England Biolabs, Inc. Beverly, Mass.). De twee organismen konden gemakkelijk worden onderscheiden omdat B. holmesii twee ncii-sites heeft, terwijl B. pertussis en alle andere Bordetella spp. hebben slechts één ncii-site binnen de versterkte regio. Het sputumisolaat werd vervolgens geïdentificeerd als B. pertussis (Fig. 2) en is gemeld als een opportunistische longpathogeen bij met humaan immunodeficiëntievirus geïnfecteerde patiënten (4, 5).vervolgens hebben we onderzocht of de genotypische identificatie van organismen rechtstreeks uit klinische gramkleurpreparaten met universele primers een haalbare en reproduceerbare methode is. Het type fixatie (warmte, 100% methanol en 100% ethanol) en de aanwezigheid van kleurstofresten na gramkleuring zoals hierboven beschreven, interfereren niet met de PCR. Een detectiegrens van 1.500 CFU/µl sputum (6 tot 30 organismen per olie-onderdompelings-veld) werd gevonden, wat vergelijkbaar is met andere rapporten (14). Voor deze bevinding werden drie willekeurige klinische sputummonsters gepoold zonder bacteriën op gramkleuring of in kweek, verrijkt met gedefinieerde hoeveelheden Escherichia coli (ATCC 25922), vast en Gram gekleurd, en van het objectglaasje geschraapt zoals hierboven beschreven. Verscheidene willekeurig gekozen klinische steekproeven werden getest, en wanneer een overheersend organisme op microscopie zichtbaar was, kwam zijn identificatie overeen met de gekweekte ziekteverwekker (Tabel 1).

onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder beschreven assays. In tegenstelling tot eerdere rapporten, waarin DNA eerst wordt geëxtraheerd uit sputum en soortspecifieke primers worden gebruikt (2, 11, 14, 19, 20), onze Analyse gebruikt DNA dat direct van Gramkleurige dia ‘ s zonder extractiestappen wordt teruggewonnen en maakt gebruik van universele primers, waardoor de identificatie van een brede waaier van bacteriën met een eenvoudig protocol mogelijk is. Zoals getoond, kan dit zelfs in aanwezigheid van normale achtergrond ingezeten flora worden bereikt omdat het aantal PCR-cycli beperkt is, waarbij voor concurrerende versterking van bacterieel DNA wordt toegestaan. Aangezien de kwaliteit van het ingediende specimen en de relatieve verhoudingen van morfologisch verschillende microben gemakkelijk op Gramvlekken kunnen worden bepaald, kunnen geschikte uitstrijkjes voorafgaand aan de versterking van DNA worden geselecteerd. Bovendien dient het Gramkleinverschijnsel van het overheersende organisme als interne kwaliteitscontrole na genotypische identificatie. Net als bij fenotypische identificatie, moeten de resultaten van onze assay worden gecorreleerd met het klinische beeld voordat behandelingsbeslissingen worden genomen, aangezien geen van beide methoden betrouwbaar onderscheid kan maken tussen kolonisatie en infectie.

van de weinige rapporten in de Engelse taalliteratuur die de terugwinning van nucleïnezuur uit klinische specimens op glasplaten beschrijven (3, 8), heeft tot nu toe geen enkele DNA-amplificatie beschreven na terugwinning van bacteriën uit Gramkleurige glaasjes. Onze methode is snel en betrouwbaar en kan worden gebruikt als een hulpmiddel in gevallen waarin organismen in overvloed worden gezien op klinische gramkleurige objectglaasjes, maar niet in cultuur kunnen worden teruggevonden. De techniek kan bijzonder nuttig zijn wanneer retrospectief een diagnose wordt gevraagd of nadat de oorspronkelijke monsters zijn weggegooid.