hogedrukvloeistofchromatografie massaspectrometrie is een buitengewoon veelzijdige Instrumentele techniek waarvan de wortels liggen in de toepassing van meer traditionele vloeistofchromatografie op theorieën en instrumenten die oorspronkelijk werden ontwikkeld voor gaschromatografie (GC). Zoals de naam suggereert bestaat de instrumentatie uit een hoge prestatie vloeistofchromatograaf (HPLC) die via een geschikte interface aan een massaspectrometer (MS) is bevestigd. Het primaire voordeel HPLC / MS heeft over GC / MS is dat het een veel bredere waaier van componenten kan analyseren. De samenstellingen die thermisch labiel zijn, hoge polariteit tentoonstellen of een hoge moleculaire massa hebben kunnen allen gebruikend HPLC/lidstaten worden geanalyseerd, kunnen zelfs de proteã nen routinematig worden geanalyseerd. Oplossingen die zijn afgeleid van interessante monsters worden geïnjecteerd op een HPLC-kolom die bestaat uit een smalle roestvrijstalen buis (meestal 150 mm lengte en 2 mm Inwendige diameter, of kleiner) verpakt met fijne, chemisch gemodificeerde kiezeldeeltjes. De verbindingen worden gescheiden op basis van hun relatieve interactie met de chemische coating van deze deeltjes (stationaire fase) en het oplosmiddel dat door de kolom wordt geëlimineerd (mobiele fase). De componenten die uit de chromatografische kolom eluteren worden dan via een gespecialiseerde interface aan de massaspectrometer geà ntroduceerd. De twee meest gebruikte interfaces voor HPLC / MS zijn de electrospray ionisatie en de atmosferische druk chemische ionisatie interfaces.
Electrospray-ionisatie
bij electrospray-ionisatie wordt de analyt in de bron gebracht bij debieten in de Orde van grootte van 1µl min-1. De stroom van de analyteoplossing gaat door de elektrospraynaald die een hoog potentieel verschil (met betrekking tot de tegenelektrode) heeft toegepast op het (typisch in de waaier van 2.5 tot 4 kV). Dit dwingt het spuiten van geladen druppels van de naald met een oppervlakte lading van dezelfde polariteit aan de lading op de naald. De druppels worden afgestoten van de naald naar de bron monsterkegel op de teller elektrode (weergegeven in blauw). Als de druppels de ruimte tussen de punt van de naald en de kegel doorkruisen, verdamping van het oplosmiddel optreedt. Dit is omcirkeld op de vijg.1 en uitgebreid in Fig.2. Als de verdamping van het oplosmiddel optreedt, krimpt de druppel tot het punt bereikt dat de oppervlaktespanning de lading niet langer kan verdragen (de Rayleigh-limiet) op welk punt een “Coulombische explosie” optreedt en de druppel uit elkaar wordt gescheurd. Dit veroorzaakt kleinere druppeltjes die het proces evenals naakte geladen analytemolecules kunnen herhalen. Deze geladen analyt moleculen (ze zijn niet strikt ionen) kunnen afzonderlijk of vermenigvuldigen geladen. Dit is een zeer zachte ionisatiemethode omdat de analyt bij ionisatie zeer weinig restenergie vasthoudt. Het is de generatie van vermenigvuldigde geladen molecules die componenten met een hoog molecuulgewicht zoals proteã nen toelaat om worden geanalyseerd aangezien de massawaaier van de massaspectrometer zeer wordt verhoogd aangezien het eigenlijk de massa aan ladingsverhouding eerder dan massa per se meet. Het belangrijkste nadeel van de techniek is dat zeer weinig (gewoonlijk geen) fragmentatie wordt veroorzaakt hoewel dit door het gebruik van tandem massaspectrometrische technieken zoals MS/MS of MSn kan worden overwonnen.
figuur 1 een schema van een ESI-interface
Figuur 2 een schema van het mechanisme van ionvorming
Atmosferische druk chemische ionisatie
Atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) is een analoge ionisatiemethode als chemische ionisatie (ci). Het significante verschil is dat APCI bij atmosferische druk voorkomt en zijn primaire toepassingen heeft op het gebied van ionisatie van laagmassaverbindingen (APCI is niet geschikt voor de analyse van thermisch labiele verbindingen). De algemene opzet van de bron (zie Fig. 3) lijkt sterk op ESI. Waar APCI verschilt van ESI, is de manier waarop ionisatie plaatsvindt. In ESI, ionisatie wordt gekocht over door het potentiële verschil tussen de spuitnaald en de kegel samen met snelle maar zachte desolvatie. In APCI wordt de analyte-oplossing geà ntroduceerd in een pneumatische vernevelaar en gedesolveerd in een verwarmde kwartsbuis voordat er interactie plaatsvindt met de corona-ontlading die ionen creëert. De corona ontlading vervangt de elektronenfilament in CI – de atmosferische druk zou snel “burn – out” alle filamenten – en produceert primaire N2°+ en N4° + door elektronenionisatie. Deze primaire ionen botsen met de verdampte oplosmiddelmoleculen om secundaire reactantgasionen te vormen-b. v.H3O+ en (H2O)nH+ (zie Fig. 4). Deze reactantgasionen ondergaan dan herhaalde botsingen met analyte die in de vorming van analyteionen resulteren. De hoge frequentie van botsingen resulteert in een hoge ionisatie-efficiëntie en thermalisatie van de analyte-ionen. Dit resulteert in spectra van overwegend moleculaire species en adductionen met zeer weinig fragmentatie. Zodra de ionen worden gevormd, gaan ze het pompen en concentreren Stadium in vrijwel hetzelfde als ESI.
Figuur 3 een schema van de componenten van een APCI-bron
Figuur 4 een gedetailleerder beeld van het mechanisme van APCI
diagrammen en tekst (gedeeltelijk) door Dr. Paul Gates, School of Chemistry, Universiteit van Bristol