de komst van aërobe biologie werd aangekondigd ongeveer twee miljard jaar geleden, toen primitieve cyanobacteriën het vermogen ontwikkelden om water te fotooxidizen. Zuurstof kwam vrij als afvalproduct, en atmosferische O2 niveaus steeg snel. Deze snelle verandering naar een zuurstofatmosfeer introduceerde een verwoestende verontreinigende stof, maar uiteindelijk evolueerden organismen die profiteerden van de sterke drijvende kracht voor O2-reductie. Enzym actieve plaatsen die konden binden en activerende geëvolueerd zuurstof waren, en nieuwe klassen van biochemie die O2 als thermodynamische gootsteen gebruiken om anders ongunstige reacties te drijven werden mogelijk. De efficiëntie van het voedselmetabolisme veranderde dramatisch. De hoeveelheid ATP die zou kunnen worden geproduceerd door glucose aerobically te metaboliseren, bijvoorbeeld, steeg bijna 20-voudig. Eukaryotes verschenen kort na de oxygenic atmosfeer en werden uiteindelijk gevolgd door de diverse waaier van meercellige organismen die vandaag bestaan. In onze aërobe biochemie wordt O2 gebruikt in een overvloed aan synthetische reacties die fundamenteel zijn voor bijna alle aspecten van celgroei, – ontwikkeling en-reproductie.
ondanks zijn biochemische veelzijdigheid wordt echter >95% van de zuurstof die we verbruiken gebruikt in de ademhaling. Hoog-energie elektronen afgeleid van voedsel doorkruisen de mitochondriale elektronentransportketen in een reeks exergonische redoxreacties. Deze energetisch downhill elektronentransfers worden gebruikt om de chemisosmotic proton gradiënt te ontwikkelen die uiteindelijk ATP produceert. Zuurstof is de uiteindelijke elektron acceptor in deze respiratoire cascade, en zijn reductie tot water wordt gebruikt als een voertuig waarmee de mitochondriale keten van energiezuinige, verbruikte elektronen te wissen. Het enzym dat dit proces katalyseert, cytochroom oxidase, overspant het mitochondriale membraan. Het bindt, activeert, en vermindert tot 250 molecules van O2 per seconde en koppelt de energie die in dit proces wordt vrijgegeven aan de translocatie van protonen die aan de chemiosmotic gradiënt bijdragen. Het mechanisme waardoor cytochroom oxidase deze opmerkelijke chemie katalyseert is intensief bestudeerd. De resultaten die in dit nummer worden gerapporteerd door Fabian, Wong, Gennis en Palmer geven een nieuw inzicht in dit proces en ondersteunen het groeiende besef dat er verenigende concepten bestaan voor de manier waarop zuurstof-gebruikende enzymen O2 activeren voor O O O binding splitsing en reductie (1).
de reductie van O2 in cytochroom-oxidase treedt op onder ernstige beperkingen. Het proces vindt plaats met weinig overpotentiaal, het vrijkomen van gedeeltelijk gereduceerde, giftige zuurstof tussenproducten uit de actieve site wordt geminimaliseerd, en de vrije energie die beschikbaar is in O2 reductie wordt gekoppeld aan een hoog rendement aan Proton translocatie (2, 3). Het enzym werkt onder deze beperkingen door het gebruik van een Heme Fe, genaamd heme a3, en een koper-ion, genoemd CuB, in een binucleair centrum waarin O2 bindt en wordt verminderd (zie Fig. Fig.1).1). De elektroneninvoer naar deze plaats komt van cytochroom c door middel van een tweede heemijzer, heme a, en een tweede koperen centrum, CuA. Onlangs leverden Yoshikawa ’s groep (4) en Michel’ s groep (5) onafhankelijk en gelijktijdig kristalstructuren van het enzym die een diep inzicht hebben gegeven in vele aspecten van de katalytische cyclus, in het bijzonder hoe protonen en zuurstof waarschijnlijk door het eiwit bewegen. Het mechanisme van O2 reductie door oxidase werd nagestreefd door een aantal groepen met een verscheidenheid aan spectroscopische technieken (voor beoordelingen, zie refs. 6 en 7). Uit dit werk kan een vereenvoudigde reactiesequentie die transiënte, maar detecteerbare tussenproducten in het binucleaire centrum omvat als volgt worden geschreven (zie ook Fig. Fig.2): 2):
De P-en F-soorten hebben met name de aandacht getrokken, omdat zij betrokken zijn bij het pompmechanisme dat proton translocatie aandrijft (8). Recent werk van Michel (9) en van Wikström en collega ‘ s (10) heeft zowel de vooruitgang als de onzekerheden in ons begrip van het mechanisme belicht dat exergone elektronen transfers naar zuurstof koppelt aan endergone proton beweging over het membraan.
het binucleaire centrum in cytochroom-oxidase. Heme a3 en CuB worden weergegeven samen met de proximale ligand voor het heemijzer, H376, en de welp ligand, H240, die is Vernet met Y244 (24, 25). O2 binding en reductie vindt plaats in het gebied tussen het a3 ijzer en de welp.
een vereenvoudigd schema voor de reactie tussen cytochroom-oxidase en O2. De binucleaire site, die heme a3, CuB, en de cross-linked, H240 – Y244 (H-Y) structuur bevat, wordt getoond. Reductie en protonatie van de geoxideerde vorm van het centrum produceert de gereduceerde site. Dit bindt O2 aan vorm aanvankelijk de oxy species, die verder reageert om P en F tussenproducten te produceren, alvorens de geoxideerde vorm van het enzym te regenereren. De reductie van P en F wordt beperkt door Proton transfer reacties, zoals aangegeven. De stappen tussen P en de gereduceerde vorm van de site zijn betrokken bij Proton pompprocessen, die worden aangegeven door rode pijlen. De stoichiometrie van deze stappen is een kwestie van lopend onderzoek, hoewel tot vier protonen gedurende de volledige cyclus kunnen worden gepompt.
een voortdurende kwestie bij het ontrafelen van de zuurstofchemie in het binucleaire centrum in cytochroom-oxidase en de koppeling ervan aan de protonpomp is het vaststellen van de moleculaire structuren van de tussenproducten in het bovenstaande schema. Men is het erover eens dat het F-tussenproduct een ferryl-oxo-tussenproduct bevat bij heme a3, a34+⩵O (3, 6, 11, 12), maar de structuur van P is een kwestie van aanzienlijke controverse geweest. De eerste toewijzingen van deze soort veronderstelden dat het een intacte band bevatte, A33 + – O2 species soorten, vandaar de aanduiding als P voor “peroxy” (bijv. refs. 3, 8 en 13). Weng en Baker interpreteerden hun optische gegevens echter om aan te geven dat O O O-splitsing al had plaatsgevonden bij P en dat ook deze soort een A34+O O-structuur had in het binucleaire centrum (14). Deze conclusie werd vervolgens ondersteund door verschillende spectroscopische onderzoeken (15-17). Kitagawa, Proshlyakov, en hun collega ‘ s slaagden erin om Raman spectroscopie te gebruiken om de A34+⩵o stretching beweging (18, 19) te detecteren in een vorm van P die wordt gegenereerd door peroxide toe te voegen aan het geoxideerde enzym. Vervolgens bleek dat dezelfde trilling kon worden waargenomen wanneer zuurstof wordt toegevoegd aan een twee-elektron gereduceerde vorm van het enzym, wat bevestigt dat zuurstofchemie en peroxidechemie in oxidase doorgaan via gemeenschappelijke tussenproducten (20). Bovendien bleek uit het verloop van het verschijnen van P in dit werk dat deze soort kinetisch competent is (zie ook refs. 21 en 22). Dus, uit het spectroscopische werk, en Uit recente computationele werk ook (23), de opkomende visie is dat P is inderdaad een O⩵O bond-gespleten soort.
het werk gerapporteerd door Fabian et al. (1) levert nieuw, onafhankelijk en overtuigend bewijs dat de O O O-binding wordt gesplitst in cytochroom-oxidase op het P-niveau. In hun experimenten redeneerden ze dat geen van beide zuurstofatomen in een hecht-intacte peroxy-structuur waarschijnlijk zal uitwisselen met oplosmiddel water. Als P echter voorkomt als de A34 + O O soort, dan verwacht men dat het tweede zuurstofatoom zich waarschijnlijk op het niveau van hydroxide of water bevindt en dat deze zuurstof goed kan uitwisselen met water in de waterige buffer. Gebruikend 18O2 als substraat in een waterige buffer die h216o bevatte, vingen zij de P tussenpersoon en analyseerde voor de verschijning van H218O. Hun massaspectrometrische resultaten tonen duidelijk aan dat een enkel zuurstofatoom van het 18o2 substraat uitwisselbaar is met oplosmiddelwater, in uitstekende overeenstemming met hun analyse hierboven en de toewijzing van P als een binding-gespleten, ferryl-oxo-species.
het besef dat P een A34 + O O-structuur heeft, heeft een aantal belangrijke implicaties. De omzetting van gebonden O2 in de oxy-species in hydroxide (of water) en een ferryl-oxo in P vereist in totaal vier elektronen. Slechts drie, echter, zijn direct beschikbaar in het binucleaire centrum—twee van heme a3 als het gaat van de +2 naar de +4 valentie staat en een van Welp als het geoxideerd van cuprous naar cupric. De bron van het vierde elektron is onduidelijk. Oxidatie van de heme macrocycle, zoals in verbindingen I in sommige peroxidasen, kan worden geëlimineerd op basis van Raman en optische gegevens (6, 7), en Cu3+ is niet gedetecteerd in biologisch milieu. De meest waarschijnlijke kandidaat is dan een redox-actieve eiwitzijketen, zoals in cytochroom C peroxidase, waarin tryptofaan redox actief is, of in prostaglandinesynthase, dat een oxideerbaar tyrosineresidu bevat (24). Yoshikawa en collega ‘ s (25) leverden opvallend kristallografisch bewijs dat het optreden van een redox-actieve zijketen sterk ondersteunt. Ze toonden aan dat Y244 in het binucleaire centrum is Vernet met een van de welp liganden, H240, en dat de fenol kopgroep zo is georiënteerd dat de-OH groep direct in de O2-bindende holte wijst (Fig. (Fig.1).1). Michel heeft vergelijkbare kristallografische gegevens gerapporteerd (26), en Buse en collega ‘ s hebben onlangs biochemische gegevens gerapporteerd die het voorkomen van de H240-Y244 crosslink ondersteunen (27). Recente EPR-gegevens zijn ook gemeld die wijzen op de aanwezigheid van tyrosylradicalen wanneer peroxide wordt toegevoegd aan het rustenzym, hoewel de specifieke zijketen(en) niet zijn geïdentificeerd (28, 29). Samen suggereren deze resultaten sterk dat de Vernet tyrosine de bron is van het vierde elektron in de activering en reductie van O2 door cytochroom-oxidase. Dit vermoeden leidt tot de vereenvoudigde reactiecyclus in Fig. Fig.2,2, waarin de Vernet H-Y structuur expliciet wordt getoond en voorgesteld om geoxideerd te worden tot het neutrale tyrosylradicaal in het P-tussenproduct.
het schema in Fig. Fig.22 belicht de analogieën tussen cytochroom oxidase en de peroxidasen en katalasen in termen van zuurstof–zuurstof binding splitsing chemie en in termen van de producten die voortvloeien uit de reactie. In oxidase, haalt het enzym drie elektronen uit metalen in de actieve plaats en een vierde elektron uit een organisch deel om O2 in één stap te verminderen tot o⩵ en OH -. Beide producten bevinden zich op het niveau van het water, hoewel verdere protonatie en afgifte pas in latere stappen van de reactie optreden. In peroxidasen en katalasen haalt het enzym één elektron uit een metaal in de actieve plaats en een tweede elektron uit een organisch deel om H2O2 in één stap te reduceren tot O⩵ en OH—. In peroxidasen en katalasen is het directe product van deze chemie verbinding I, die een ferryl-oxo-soort en een organisch radicaal bevat. Deze structuren zijn precies analoog aan de A34+⩵o/radicale structuur die in P voorkomt in cytochroom-oxidase. Het organische radicaal in verbinding I wordt in een volgende stap in de peroxidase-en catalase-enzymen gereduceerd tot verbinding II, die de ferryl-oxo-structuur behoudt. In oxidase, komt de zelfde chemie voor om F tussenpersoon te produceren. De gelijkenis in chemie van de zuurstof-metaboliserende heme-eiwitten is pas ontstaan met de realisatie van de A34+⩵o-structuur voor P en suggereert dat andere zuurstof-metaboliserende enzymen dezelfde soort chemie kunnen volgen in het activeren en verminderen van zuurstof en peroxiden.
uit Fig. Fig.22 in termen van hoe oxidase zuurstof chemie koppelt aan de protonpomp. De pompstappen treden pas op nadat P is gevormd (8-10), wat betekent dat het enzym eerst O2 activeert en reduceert tot volledig gereduceerde maar onvolledig geprotoneerde productwatermoleculen; het enzym voltooit de vier-elektronenoverdracht van elektronen aan zuurstof, en slaat de vrije energie op die als hoogst oxyderende a34+⩵O en radicale species resulteert, alvorens de pomp in dienst te nemen. Recente berekeningen van de bond-splitsingschemie ondersteunen dit idee, aangezien de resultaten erop wijzen dat de reductie van O2 tot oxo en hydroxo met vorming van een radicaal en een ferryl-oxo dicht bij thermoneutraal ligt (23). Dit is een opmerkelijk effectieve strategie om toxische, gedeeltelijk verminderde zuurstofsoorten te vermijden, aangezien er geen voorkomen in de reactiecyclus. Bovendien, door het overbrengen van de vrije energie die zal worden gebruikt om de pomp van substate zuurstofproducten naar het eiwit te drijven, lijkt het alsof oxidase de controle en efficiëntie heeft gemaximaliseerd waarmee het het proton-translocerende apparaat kan bedienen.