Tijdens de translocatie stap van de rek-fase van de proteïne synthese, het mRNA wordt bevorderd door een codon, gekoppeld aan de beweging van de ongeladen trna ‘ s reageert van het ribosomaal Een (aminoacyl) P (peptidyl) en P naar E (exit) sites, in een proces gekatalyseerd door rek factor EF-G (1). Eerst, beweegt tRNAs zich op de subeenheid van de jaren ’50 in P/E en A / P hybride Staten, door beweging van tRNA anticodon stam-loops (ASLs) van de plaatsen van de jaren’ 30 subeenheid A en P aan de plaatsen P en E, respectievelijk, gekoppeld aan beweging van hun geassocieerde mRNA-codons (2). De eerste stap gaat gepaard met intersubunit rotatie (3-7), terwijl de tweede stap EF-G·GTP vereist, en de rotatie van het 30S subunit head domein (8-11) omvat. Hoewel onlangs veel is geleerd over de structurele basis van P-tRNA beweging naar de e-site (9, 10, 12, 13), translocatie-tussenproducten die A-tRNA bevatten, zijn moeilijker te vangen. Dus veel van ons denken over de structurele basis van A-tRNA en mRNA beweging is gebaseerd op kristalstructuren van EF-G gebonden aan vacante (14) of P-tRNA-bevattende ribosoomcomplexen gevangen in klassieke (15) of hybride toestanden (10, 12, 13) en twee cryo-EM structuren van 70S ribosoom-EF-G complexen die twee tRNAs gebonden in P/E en A/P* hybride toestanden (16), of in ap/P en pe/E chimerische hybride toestanden (11).
hier rapporteren we de kristalstructuur van een 70S ribosoom translocatie intermediair die EF-G, mRNA, en twee tRNAs bevat – een gedecyleerde tRNA gebonden in de pe/E toestand en een peptidyl-tRNA gevangen in een ap/ap chimerische hybride toestand. Het complex werd gevormd met T. thermophilus 70s ribosomen, een 39-nucleotide mRNA, elongator tRNAMet in de P plaats en N-acetyl-Val-tRNAVal in de a plaats. Om de translocatie intermediair te vangen, voegden we neomycine toe om de voltooiing van de translocatie te blokkeren, en fusidinezuur om afgifte van EF-G te voorkomen (aanvullende methoden; Fig. S1). De structuur werd opgelost met diffractiegegevens tot 3,8 Å, verkregen uit een enkelkristal (tabel S1). Voorbeelden van elektronendichtheid worden getoond in aanvullende materialen (Fig. S2–S13). Ten opzichte van het klassieke ribosoom (17), ondergaat het hoofd van de 30S subeenheid een grote 21° tegen de klok in rotatie, en het 30S lichaam een 2,7° rotatie ten opzichte van de 50S subeenheid (Fig. 1, Fig 2A, B). De P-tRNA anticodon stam-loop (ASL) beweegt met het 30S hoofd in een positie tussen de P plaats van het 30S hoofd en de e plaats van het 30S lichaam (pe chimerische toestand); Fig. 1D, E), terwijl het acceptoruiteinde volledig naar de 50S e-locatie gaat (Fig.1C), waardoor een pe/E-chimerische hybride toestand (9-11) ontstaat. De A-tRNA ASL beweegt naar binnen ~4A van de P-site elementen van de jaren ‘ 30 lichaam (Fig. 1D); zijn elleboog draait naar de klassieke 50S P plaats, maar zijn acceptor einde is gebonden tussen de 50S subeenheid A en P plaatsen (Fig. 1C), die een ap/ap chimerische hybride toestand vormen. De grote, EF-G-afhankelijke rotatie van de 30S hoofd in onze structuur herpositioneert helix H38 van 23S rRNA, waardoor de A-tRNA elleboog om de positie van de p-site tRNA elleboog te bereiken (Fig. S14). Domein IV van EF-G wordt ingeklemd in de plaats van convergentie van het a-plaats mRNA codon, de anticodon lijn van ap / ap tRNA, en 16S en 23S rRNAs bij intersubunit brug B2a, gelijktijdig contacterend alle vier RNAs (Fig. S15).
(a) 70S ribosoom with tRNAs bound in classical A/A and P/P states (17); (B) Translocation intermediate complex, showing tRNAs trapped in intermediate chimeric hybrid AP/ap and pe/E states. (C) vergelijking van posities van tRNA in klassieke toestanden en in de translocatie tussenliggende, uitgelijnd op de 50S subeenheid; (D) relatieve posities van tRNA ASLs, uitgelijnd op de 30s subeenheid lichaam of (e) Hoofd. Moleculaire componenten zijn gekleurd door als: 16S rRNA, cyaan; 30s eiwitten, blauw; 23S rRNA, grijs; 5S rRNA, Lichtblauw; 50S eiwitten, magenta; mRNA, groen; A/A en ap/ap tRNAs, geel; P/P en pe/E tRNAs, rood; EF-G, oranje.
(A-B) posities van tRNA ‘ s in het (a) classical-state ribosoom en (B) translocatie intermediair. (C-D) interacties van de tRNA ASLs en mRNA als ze bewegen van de (C) A en P klassieke toestanden naar de (D) ap en pe chimerische hybride toestanden. (E–F) herschikking van de 966 lus (h31) van 16S rRNA in de 30S subeenheid hoofd van zijn (e) klassieke p-tRNA-bindende positie aan (F) vormt een oppervlak-fitting zak rond de AP/AP tRNA ASL.
hoewel rotatie van het hoofd in de jaren 30 duidelijk de translocatie van de ASL van de P-site vergemakkelijkt( 9-11), wordt de ASL van de a-site getransloceerd door een ander mechanisme. De P-site ASL beweegt precies met 30s hoofd rotatie in de pe / E-staat, terwijl de a-site ASL verder is verplaatst dan de rotatiebeweging van het hoofd in de AP-staat op de 30S subeenheid (Fig. 1E). Beweging van de a-site ASL precies met rotatie van het hoofd zou resulteren in ernstige botsing met domein IV van EF-G als het is geplaatst in ons complex, die, samen met het contact gevormd tussen de top van domein IV en de codon-anticodon helix van de AP/AP tRNA (Fig. S16), suggereert dat de beweging van mRNA en ASL zijn gekoppeld aan die van domein IV.de extra verplaatsing van de AP/AP ASL brengt het dicht bij de pe/E ASL (Fig. 2C, D) (11). De positie van de kop kan worden gestabiliseerd door interactie tussen fosfaat 1210 van 16S rRNA met domein IV van EF-G bij Gly531.
meest opvallend is de herschikking van de 16S rRNA 966 lus in het hoofd van de jaren ‘ 30, die van de P-site afbreekt om naar de a-site te reiken, waar het contact initieert met de gedeeltelijk getransloceerde ap / AP-ASL (Fig. 2E, F). Deze herschikking impliceert verstoring van de verpakking van m22G966 tegen ribose 34 van de P-plaats ASL (18, 19), en vorming van een oppervlakte-passende zak rond AP/AP-ASL door nucleotiden A965, m22G966 en C1400. In een kristal structuur van het overeenkomstige single-tRNA complex (10) (vijg. S6), werd de pe/e tRNA ASL gevonden om alle canonieke p-site contacten met het hoofd van de jaren ‘ 30, met inbegrip van de 966 lus, te onderhouden aangezien het naar de e-site roteert. Echter, in de twee-tRNA complex hier gerapporteerd, slechts een sub-set van de P-site 30S hoofd interacties met de pe/E ASL worden gehandhaafd, waarbij g1338, A1339, A1340, en de C-terminale staart van eiwit uS9. De vorming van post-translocatieinteracties gelijktijdig met verstoring van pre-translocatieinteracties, stelt een mechanisme voor voor hoe ASLs tussen de A en P plaatsen worden overhandigd. Het kan ook een eerste verschuiving in Contacten vertegenwoordigen die moet worden verstoord om de pe/E tRNA ASL vrij te geven voorafgaand aan back-rotatie van het 30S hoofd in de laatste stadia van translocatie (20, 21).
het netwerk van interacties gevormd tussen de geconserveerde lus 1 (residuen 499-504) in domein IV van EF-G, de AP/AP ASL en zijn mRNA-codon (Fig. S15) (11) zijn vergelijkbaar met die in de post-translocatietoestand (15), wat erop wijst dat ze gedurende de translocatiecyclus worden gehandhaafd. Hun gelijkenis met de minor-groef interacties gemaakt door A1492 en A1493 met de codon-anticodon helix in de decodeerplaats (22) suggereert dat ze kunnen helpen om de juiste codon-anticodon koppeling te handhaven tijdens de beweging tussen de A-en P-locaties (15), en zijn consistent met het voorstel dat EF-G translocatie vergemakkelijkt door de destabiliserende interacties in de jaren ‘ 30 decodeerplaats (23).
interacties tussen het mRNA en elementen van het hoofd van de jaren ‘ 30 binnen de stroomafwaartse mRNA-ingangstunnel zijn voorgesteld om het mRNA met de tRNA naar voren te brengen tijdens rotatie van het hoofd (17). Nochtans, is het niet duidelijk dat de nettobeweging van mRNA op deze manier zou kunnen worden gehandhaafd, omdat deze interactie tijdens hoofdrotatie wordt verstoord. Wij vinden dat de verlengde staart van mRNA, als het uit de stroomafwaartse tunnel naar voren komt, omhoog kromt om aan de oppervlakte van proteã ne uS3 in het hoofd van de subeenheid te binden (Fig. 3, S17). Aldus, zou de voorwaartse hoofdrotatie mRNA actief in de richting van translocatie bewegen. De vergelijking van de positie van een verwijzingsnucleotide op mRNA in de geroteerde en niet-geroteerde Staten toont verder aan dat de voorwaartse hoofdrotatie mRNA door één codon (Fig. 3D), ondersteunend de mogelijkheid dat mRNA actief door het ribosoom tijdens translocatie wordt bewogen. Aangezien de afmetingen van de stroomafwaartse tunnel de ingang van een RNA-helix uitsluiten, moet de verstoring van de secundaire structuur van mRNA door de ribosomale helicase (24) bij of dichtbij de ingang van de tunnel voorkomen, door interactie met het ribosoom buiten de tunnel. De Binding van de mRNA-staart die onmiddellijk de ingang van de tunnel uitsluitend aan het hoofd van de jaren ‘ 30 flankeert, zorgt voor een dergelijke interactie. De krachten die door hoofdrotatie worden gecreeerd konden zo basis het in paren rangschikken in spiraalvormige elementen van mRNA destabiliseren aangezien zij de stroomafwaartse tunnel ingaan.
(A) de ingang naar de stroomafwaartse mRNA-ingangstunnel is omgeven door eiwitten uS3, uS4 en uS5. Posities + 14 tot + 21 contact een positief geladen patch op het oppervlak van eiwit uS3 in de jaren ‘ 30 hoofd (Fig. S17). (B) pad van het mRNA stroomafwaarts en (c) 90° geroteerd zicht. (D) Docking op de jaren ‘ 30 lichaam van de klassieke structuur (17) (grijs) laat zien dat de rotatie van het hoofd in de AP/AP tussenstructuur transloceert de mRNA door een codon. A-codon (geel) en P-codon (rood).
in de klassieke toestand vormen C74 en C75 in de CCA-staart van P-site tRNA basenparen met respectievelijk g2252 en G2251 in de P-lus (H80) van 23S rRNA, terwijl C75 van de a-site tRNA paren met G2553 in de A-lus (h92) (18, 25, 26). Deze interacties plaatsen de peptidyl-en aminoacyl-delen voor de peptidyltransferasereactie (27), die een gedeciyleerde tRNA in de P-plaats, en een peptidyltrna in de a-plaats verlaat. Een kritische stap in translocatie is daarom de daaropvolgende beweging van het peptidyl-CCA-eind van de A-lijn aan de P-lijn. De structuur van de translocatie tussenliggende onthult een chimerische toestand, verschillend van de eerder beschreven (Fig. S18), waarbij het acceptoreinde van peptidyl-tRNA gelijktijdig met zowel de A als P-lijnen in wisselwerking staat (Fig 4). In deze staat, wordt het basisparen van C75 met G2553 van de lus a behouden, terwijl de beweging van zijn acceptorsteel in een positie dichtbij die van klassieke p-plaats tRNA g2252 en G2253 in een herschikte lus P toestaat om de tRNA-backbone op posities 72 en 70 te contacteren (Fig. 4B). Aldus, wordt het eind van de acceptorstam van ap/ap-tRNA verankerd op de P-lijn, die overdracht van zijn aangrenzende C74 en C75 residuen van de A-lijn aan de P-lijn vergemakkelijken. A76 van de AP / AP tRNA is op dezelfde manier georiënteerd als waargenomen voor tRNA gebonden in de p/p klassieke toestand (17), met zijn N-acetyl-valine peptidylgroep gepositioneerd bij de ingang van de peptide uitgangstunnel, terwijl C74 en C75 hun interacties met de A-lus van 23S rRNA (Fig. 4, S19).
tijdens de translocatie beweegt het 3 ‘ acceptor-einde van peptidyl-tRNA van de (A) klassieke a/a-toestand naar de (B) tussenliggende ap/ap-toestand naar de (C) klassieke P/P-toestanden, vergemakkelijkt door conformationele veranderingen in de A-en P-lussen.
de AP / AP-tRNA kan overeenkomen met intermediaire toestanden die kinetisch zijn gekarakteriseerd. Bij kinetische studies met betrekking tot de fluorescentieblussers is een EF-G-afhankelijk intermediair (int) vastgesteld waarbij de peptidyl-tRNA-elleboog van de a-site naar de P-site beweegt, maar slechts gedeeltelijk reactief blijft met de aminoacyl-tRNA-mimische puromycine, wat erop wijst dat het CCA-uiteinde ervan niet volledig in de P-site is ondergebracht (28). Kinetische studies waarbij een sonde direct aan het peptidyl-tRNA CCA-einde werd bevestigd, identificeerden EF-G-afhankelijke translocatie-tussenproducten waarbij het acceptor-einde van peptidyl-tRNA naar de P-plaats beweegt, maar puromycine-unreactive blijft (29). De eigenschappen van deze tussenproducten zijn compatibel met de hier waargenomen ap/ap-toestand. De structuur van deze gevangen translocatie tussenpersoon begint te beschrijven hoe tRNA beweegt tussen de plaatsen van ribosomal A en P. De tRNA-bindingsplaatsen zelf zijn dynamisch en vormen gelijktijdige contacten tussen de a-tRNA en elementen van zowel de A-als de P-locaties, wat lijkt op het passeren van het stokje in een estafetteloop (30). Dit wordt gezien voor zowel de jaren ’30 en’ 50 subeenheden. In de 30S subeenheid, herschikking van de 966 lus van 16S rRNA releases G966 van de P-site ASL om contact op met de a-site ASL als het beweegt in de 30S p site (Fig. 2E, F). In de 50S subeenheid, herschikken de A en P lussen van 23S rRNA om beide lussen toe te staan om het 3′-acceptoreinde van de a-plaats tRNA te contacteren aangezien het zijn overgang in de 50s P plaats begint (Fig. 4). Deze bevindingen tonen aan dat de structurele dynamica van ribosomaal RNA een actieve rol speelt in het mechanisme van translocatie.