in de jaren zeventig werd de meeste vloeistofchromatografie uitgevoerd met behulp van een vaste ondersteunende stationaire fase (ook wel een kolom genoemd) die ongewijzigd siliciumdioxide of aluminiumoxide harsen bevat. Dit type van techniek wordt nu bedoeld als normaalfasechromatografie. Aangezien de stationaire fase hydrofiele in deze techniek is, zullen de molecules met hydrofiele eigenschappen binnen de mobiele fase een hoge affiniteit voor de stationaire fase hebben, en daarom aan de kolomverpakking zullen adsorberen. Hydrophobic molecules ervaren minder van een affiniteit voor de kolomverpakking, en zullen door gaan om eerst worden uitgesleten en ontdekt. Elution van de hydrofiele molecules geadsorbeerd aan de kolomverpakking vereist het gebruik van meer hydrofiele of meer polaire oplosmiddelen in de mobiele fase om de distributie van de deeltjes in de stationaire fase naar dat van de mobiele fase te verschuiven.
Reversed-phase chromatografie is een techniek waarbij alkylketens covalent worden gebonden aan de stationaire fasedeeltjes om een hydrofobe stationaire fase tot stand te brengen, die een sterkere affiniteit heeft voor hydrofobe of minder polaire verbindingen. Het gebruik van een hydrophobic stationaire fase is hoofdzakelijk het omgekeerde van normale fasechromatografie, aangezien de polariteit van de mobiele en stationaire fasen zijn omgekeerd – vandaar de termijn reversed-fasechromatografie. De Reversed-phase chromatografie wendt een polaire (waterige) mobiele fase aan. Dientengevolge, neigen de hydrophobic molecules in de polaire mobiele fase om aan de hydrophobic stationaire fase te adsorberen, en zullen de hydrofiele molecules in de mobiele fase door de kolom overgaan en eerst worden geëlueerd. Hydrophobic molecules kunnen van de kolom worden uitgewist door de polariteit van de mobiele fase te verminderen gebruikend een organisch (apolair) oplosmiddel, dat hydrophobic interactie vermindert. Hoe hydrophobischer de molecule, hoe sterker het aan de stationaire fase zal binden, en hoe hoger de concentratie van organisch oplosmiddel die nodig zal zijn om de molecule uit te lichten.
veel van de wiskundige en experimentele overwegingen die in andere chromatografische methoden worden gebruikt, zijn ook van toepassing op RPC (de scheidingsresolutie is bijvoorbeeld afhankelijk van de lengte van de kolom). Het kan voor de scheiding van een grote verscheidenheid van molecules worden gebruikt. Het wordt niet typisch gebruikt voor scheiding van proteã nen, omdat de organische die oplosmiddelen in RPC worden gebruikt vele proteã nen kunnen denatureren. Om deze reden, wordt de normale fasechromatografie meer algemeen gebruikt voor scheiding van proteã nen. Nochtans, kan de denaturatie van proteã nen in de latere analyse van de steekproeven eigenlijk voordelig zijn die van de chromatografie worden verkregen. Als een enzymatische vertering met trypsine wordt uitgevoerd op de geanalyseerde eiwitten, is lineair eiwit hiervoor geschikter. Vandaar, kan de denaturatie van proteã nen gebruikend aangewezen oplosmiddelen die het ontvouwen van de proteã nen veroorzaken eigenlijk opzettelijk zijn alvorens de gefractioneerde steekproef door massaspectrometrie te nemen.
tegenwoordig is RPC een veelgebruikte analytische techniek. Er zijn verschillende stationaire fasen beschikbaar voor gebruik in RPC, waardoor grote flexibiliteit in de ontwikkeling van scheidingsmethoden.
stationaire fasesedit
elke inerte polaire stof met voldoende verpakking kan worden gebruikt voor reversed-phase chromatografie. De populairste kolom is een octadecyl koolstofketen (C18)-gebonden silica (USP classificatie L1). Dit wordt gevolgd door C8-gebonden silica (L7), zuiver silica (L3), cyaangebonden silica (L10) en fenylgebonden silica (L11). Merk op dat C18, C8 en phenyl specifieke reversed-phase harsen zijn, terwijl cyano kolommen kunnen worden gebruikt in een reversed-phase modus afhankelijk van analyte en mobiele fase voorwaarden. Niet alle C18-kolommen hebben dezelfde retentieeigenschappen. Oppervlaktefunctionalisatie van silica kan worden uitgevoerd in een monomere of een polymere reactie met verschillende korte-keten organosilanen gebruikt in een tweede stap om resterende silanolgroepen (end-capping) af te dekken. Terwijl het algemene retentiemechanisme hetzelfde blijft, zullen subtiele verschillen in de Oppervlaktechemie van verschillende stationaire fasen leiden tot veranderingen in selectiviteit.
moderne kolommen hebben een andere polariteit. PFP is pentafluorfenyl. CN is cyano. NH2 is amino. ODS is octadecyl of C18. ODCN is een kolom met gemengde modi die bestaat uit C18 en nitril. SCX is een sterke kationische uitwisseling (gebruikt voor het scheiden van organische amines). SAX is een sterke anionische uitwisseling (gebruikt voor het scheiden van carbonzuurverbindingen).