w latach 70.większość chromatografii cieczowej wykonywano przy użyciu stałej fazy stacjonarnej (zwanej również kolumną) zawierającej niezmodyfikowaną krzemionkę lub żywice tlenku glinu. Ten rodzaj techniki jest obecnie określany jako chromatografia fazy normalnej. Ponieważ faza stacjonarna jest hydrofilowa w tej technice, cząsteczki o właściwościach hydrofilowych zawarte w fazie ruchomej będą miały wysokie powinowactwo do fazy stacjonarnej, a zatem będą adsorbować do pakowania kolumny. Hydrofobowe cząsteczki doświadczają mniej powinowactwa do pakowania kolumny i przechodzą przez, aby być eluowane i wykrywane jako pierwsze. Elucja cząsteczek hydrofilowych adsorbowanych do opakowania kolumnowego wymaga użycia bardziej hydrofilowych lub bardziej polarnych rozpuszczalników w fazie mobilnej w celu przesunięcia rozkładu cząstek w fazie stacjonarnej w kierunku fazy mobilnej.
chromatografia odwróconej fazy jest techniką wykorzystującą łańcuchy alkilowe kowalencyjnie związane z cząstkami fazy stacjonarnej w celu utworzenia hydrofobowej fazy stacjonarnej, która ma silniejsze powinowactwo do związków hydrofobowych lub mniej polarnych. Zastosowanie hydrofobowej fazy stacjonarnej jest zasadniczo odwrotnością normalnej chromatografii fazowej, ponieważ biegunowość faz ruchomych i stacjonarnych została odwrócona-stąd termin chromatografia z odwróconą fazą. Chromatografia z odwróconą fazą wykorzystuje polarną (wodną) fazę ruchomą. W rezultacie hydrofobowe cząsteczki w polarnej fazie mobilnej mają tendencję do adsorbowania do hydrofobowej fazy stacjonarnej, a hydrofilowe cząsteczki w fazie mobilnej przechodzą przez kolumnę i są eluowane jako pierwsze. Hydrofobowe cząsteczki mogą być eluowane z kolumny przez zmniejszenie polaryzacji fazy ruchomej przy użyciu organicznego (niepolarnego) rozpuszczalnika, który zmniejsza interakcje hydrofobowe. Im bardziej hydrofobowa cząsteczka, tym silniej będzie wiązać się z fazą stacjonarną i tym wyższe stężenie rozpuszczalnika organicznego, które będzie wymagane do elucji cząsteczki.
wiele rozważań matematycznych i eksperymentalnych stosowanych w innych metodach chromatograficznych ma również zastosowanie do RPC (na przykład rozdzielczość separacji zależy od długości kolumny). Może być stosowany do oddzielania szerokiej gamy cząsteczek. Nie jest on zwykle używany do oddzielania białek, ponieważ rozpuszczalniki organiczne stosowane w RPC mogą denature wielu białek. Z tego powodu normalna chromatografia fazowa jest powszechnie stosowana do rozdzielania białek. Jednak denaturacja białek może być rzeczywiście korzystna w późniejszej analizie próbek uzyskanych z chromatografii. Jeśli na analizowanych białkach przeprowadza się enzymatyczne trawienie trypsyną, bardziej odpowiednie jest do tego białko linearyzowane. Stąd denaturacja białek przy użyciu odpowiednich rozpuszczalników, które powodują rozkład białek, może być zamierzona przed pobraniem frakcjonowanej próbki za pomocą spektrometrii masowej.
obecnie RPC jest często stosowaną techniką analityczną. W RPC dostępnych jest wiele faz stacjonarnych, co pozwala na dużą elastyczność w opracowywaniu metod separacji.
fazy stacjonarne na bazie Krzemionkiedytuj
każda obojętna substancja polarna, która osiąga wystarczające upakowanie, może być używana do chromatografii odwróconej fazy. Najpopularniejszą kolumną jest krzemionka związana łańcuchem węglowym oktadecylu (C18) (klasyfikacja USP L1). Następnie następuje krzemionka związana z C8 (L7), czysta krzemionka (L3), krzemionka związana z cyjano (L10) i krzemionka związana z fenylem (L11). Należy zauważyć, że C18, C8 i fenyl są dedykowanymi żywicami odwróconymi, podczas gdy kolumny cyjano mogą być używane w trybie odwróconej fazy w zależności od warunków analitu i fazy mobilnej. Nie wszystkie kolumny C18 mają identyczne właściwości retencyjne. Powierzchniowa funkcjonalizacja krzemionki może być przeprowadzona w reakcji monomerycznej lub polimerowej z różnymi krótkołańcuchowymi organosilanami stosowanymi w drugim etapie w celu pokrycia pozostałych grup silanolu (end-capping). Podczas gdy ogólny mechanizm retencji pozostaje taki sam, subtelne różnice w chemioterapii powierzchni różnych faz stacjonarnych będą prowadzić do zmian selektywności.
Współczesne kolumny mają różną polaryzację. PFP to pentafluorfenyl. CN to cyjano. NH2 to amino. ODS to oktadecyl lub C18. ODCN jest kolumną w trybie mieszanym składającą się z C18 i nitrylu. SCX jest silną wymianą kationową (stosowaną do oddzielania Amin organicznych). SAX to silna wymiana anionowa (stosowana do oddzielania związków kwasu karboksylowego).