wprowadzenie
Kcat to numer obrotu-liczba cząsteczek substratu, z których każda strona enzymu przekształca się w produkt na jednostkę czasu. Jeśli znasz stężenie miejsc enzymatycznych, możesz dopasować Kcat zamiast Vmax podczas analizy substratu vs. krzywa prędkości.
model
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X jest stężeniem substratu.
y to prędkość enzymu.
kcat to liczba obrotów, Liczba przypadków, w których każda strona enzymu przekształca substrat w produkt na jednostkę czasu. Wyraża się to w odwrotności jednostek czasu osi Y. Na przykład, jeśli Y jest w mikromolach substratu na minutę, to kcat jest liczbą cząsteczek substratu wytwarzanych na miejsce katalityczne na minutę.
Km jest stałą Michaelisa-Mentena, w tych samych jednostkach co X. Jest to stężenie substratu potrzebne do osiągnięcia połowy maksymalnej prędkości enzymu.
Et jest stężeniem enzymatycznych miejsc katalitycznych. Jeśli enzym ma wiele podjednostek, zauważ, że Et jest stężeniem miejsc katalitycznych, które może być większe niż stężenie cząsteczek enzymu. Wprowadzone wartości Y to prędkość enzymu podana w jednostkach stężenia na czas. Et należy wpisać w tych samych jednostkach stężenia (podczas gdy jednostki czasu są zdefiniowane przez kcat).
Vmax jest maksymalną prędkością enzymu w tych samych jednostkach co Y. nie jest bezpośrednio pokazany w powyższym modelu. Jest to prędkość enzymu ekstrapolowana na bardzo wysokie stężenie substratu, więc prawie zawsze jest wyższa niż jakakolwiek prędkość zmierzona w eksperymencie. Oblicza się ją przez pomnożenie Et razy kcat.
relacja do modelu Michaelisa-Mentena
krzywa pokazana powyżej jest identyczna z krzywą zdefiniowaną przez model Michaelisa-Mentena. Uzyskasz identyczne krzywe, gdy dopasujesz dowolny model do swoich danych, i identyczne wartości dla Km.
model Michaelisa-Mentena znajduje Vmax, który jest maksymalną prędkością enzymu ekstrapolowaną na bardzo wysokie stężenia substratu. Wyraża się ją w tych samych jednostkach, których użyto do wprowadzenia wartości Y (aktywność enzymu). Zwykle łatwo jest wyrazić to (lub przekształcić w ) Mole / minutę / mg białka. Vmax określa się na podstawie liczby miejsc występowania enzymu (Et) i szybkości, z jaką enzym może przekształcić substrat w produkt (kcat).
Jeśli znasz stężenie miejsc enzymatycznych dodanych do testu (Et), możesz dopasować stałą katalityczną Kcat za pomocą powyższego modelu.
przy obliczaniu Kcat, jednostki stężenia się kasują, więc Kcat wyraża się w jednostkach czasu odwrotnego. Jest to liczba obrotów — liczba cząsteczek substratu, które każde miejsce enzymu przekształca w produkt na jednostkę czasu.
montaż modelu z pryzmatem
1.Utwórz tabelę danych XY. Wprowadź stężenie substratu do X, a prędkość enzymu do Y. Jeśli masz kilka warunków eksperymentalnych, umieść pierwszy w kolumnie A, drugi w kolumnie B itd. Możesz również wybrać przykładowe dane Prism: Kinetyka enzymów — Michaelis-Menten.
2.Po wprowadzeniu danych kliknij Analizuj, wybierz regresję nieliniową, wybierz Panel równań kinetyki enzymu i wybierz Kcat.
3.Musisz ograniczyć Et do stałej wartości, na podstawie innych eksperymentów. Aby ograniczyć wartość Et, przejdź do zakładki Ogranicz w oknie dialogowym regresji nieliniowej, upewnij się, że rozwijana obok Et jest ustawiona na „Constant equal to” i wprowadź wartość. Dla przykładowych danych wpisz 100 jako wartość Et.
jeśli nie znasz wartości Et, nie możesz dopasować kcat, ale zamiast tego powinieneś dopasować Vmax. Nie jest możliwe, aby Prism pasował zarówno do kcat, jak i Et, ponieważ oba parametry są ze sobą powiązane, a krzywa prędkości podłoża nie daje informacji o ich indywidualnych wartościach.
4.Na podstawie przykładowych danych Prism podaje, że Km= 5,886 z 95% przedziałem ufności w zakresie od 3,933 do 7,839. Najlepsza wartość dopasowania kcat wynosi 13,53 z 95% przedziałem ufności w zakresie od 11,97 do 15,09.
uwagi
•Zobacz listę założeń wszystkich analiz kinetyki enzymatycznej.
•to równanie pasuje dokładnie do tej samej krzywej co równanie, które pasuje do Vmax, a nie do liczby obrotów Kcat. Iloczyn Kcat razy Et (stężenie miejsc enzymatycznych) równa się Vmax.
•to równanie jest związane z równaniem dla enzymów allosterycznych. Ten model allosteryczny dodaje dodatkowy parametr: nachylenie h. gdy h jest równe 1,0, oba modele są identyczne.