często istnieje wiele nieporozumień co do znaczenia „jednostek enzymu”, „aktywności enzymu” i „specyficznej aktywności enzymu”. Ten przewodnik wyjaśnia te kluczowe pojęcia w prosty sposób i omawia projekt testu enzymatycznego i znaczenie działania w „zakresie liniowym”. Rozważamy również standardowe krzywe i czy należy wykreślić koncentrację lub bezwzględną ilość produktu na osi x. Omówiono kilka wskazówek na temat konfigurowania kontroli testu i odejmowania półfabrykatów. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób obliczane są wartości aktywności enzymu i przedstawiamy prosty przegląd równań kinetycznych.
definicje jednostek enzymów
Enzymologia byłaby mniej skomplikowana, gdyby wszyscy używali tej samej definicji jednostek. Poniżej podano standardową definicję jednostki:
1 jednostka (U) to ilość enzymu katalizującego reakcję 1 umol substratu na minutę (definicja a).
w większości ustawień R& D, 1 umol podłoża jest w rzeczywistości dość dużą ilością materiału i inne definicje mogą być preferowane, aby uniknąć wyrażania ilości w ułamkach jednostek. Powszechnie stosuje się następującą niestandardową definicję:
1 jednostka (U) to ilość enzymu katalizującego reakcję 1 nmol substratu na minutę (definicja B).
zauważ, że zmiana definicji ma ogromny wpływ na podaną liczbę jednostek, tzn. 1 jednostka enzymu zgodnie z definicją A równa się 1000 jednostek zgodnie z definicją B!
Możesz również zobaczyć jednostki enzymu wyrażone jako mili-Jednostka (lub mi), co oznacza po prostu tysięczną jednostkę, niezależnie od tego, jak jednostka została zdefiniowana.
wyraźnie rzeczywista ilość enzymu w probówce nie jest zmieniana po prostu przez zmianę definicji jednostki, ale wymagana jest ostrożność przy porównywaniu aktywności próbek od różnych dostawców. Tak długo, jak podane są definicje jednostek, można przekształcić podaną liczbę jednostek w nmol na min, co jest jednoznaczne i pozwala na dokonanie prawidłowych porównań.
dla jasności we własnej pracy może wolisz użyć „nmol na min” (lub „umol na min”), choć jeśli wymagane jest ciągłe powtarzanie, to wyraźnie znacznie krótszy termin „jednostka” ma swoje atrakcje.
Co To jest „aktywność enzymu”
aktywność jest podawana w jednostkach na ml (U/ml), innymi słowy nmol na min na ml (jeśli przyjęto definicję jednostki B). Tak więc wartości aktywności wyrażone w jednostkach podlegają również iluzorycznemu 1000-krotnemu „wzrostowi”, jeśli przejdzie się z definicji jednostki a do definicji jednostki B. Ponownie nie może być żadnych nieporozumień, jeśli aktywność jest wyrażana w kategoriach nmol na min na ml, a nie jednostek na ml.
ponieważ aktywność odnosi się do stężenia, wynika z tego, że dwie fiolki enzymu mogą zawierać tę samą liczbę jednostek (Łącznie), ale mają różne działania (stężenia).
Co To jest specyficzna aktywność enzymu?
specyficzna aktywność enzymu (zwykle określana po prostu jako „specyficzna aktywność”) to liczba jednostek enzymu na ml podzielona przez stężenie białka w mg/ml. Specyficzne wartości aktywności podaje się zatem jako jednostki / mg lub nmol / min / mg (jeśli stosuje się definicję jednostki B).
specyficzna aktywność jest ważną miarą czystości enzymu i wartości dla różnych partii czystego enzymu powinny być takie same, w ramach normalnego błędu eksperymentalnego.
szeregowe rozcieńczenia roztworu enzymu będą miały różne wartości aktywności enzymu, ale identyczne wartości aktywności właściwej, ponieważ przy obliczaniu aktywności właściwej rozcieńczenie próbki wpływa w równym stopniu na licznik (jednostki/ml) i mianownik (mg/ml).
chociaż specyficzna aktywność jest bardzo różna od aktywności, obliczenie specyficznej aktywności jest jednak zależne od wartości aktywności, a zatem podana specyficzna wartość aktywności będzie również zależna od definicji jednostki enzymu. Partie, które są poniżej oczekiwanej wartości specyficznej aktywności, mogą zawierać zanieczyszczenia lub cząsteczki enzymu, które uległy denaturacji.
czynniki wpływające na aktywność enzymu
w tej sekcji omówimy, dlaczego jeden enzym może mieć różne zmierzone wartości aktywności w różnych laboratoriach. Przez to rozumiemy rzeczywiste różnice w mierzonej aktywności, a nie widoczne różnice spowodowane użyciem różnych definicji jednostek.
warunki, w których przeprowadza się test, będą miały wpływ na zgłaszane wartości aktywności. Na przykład, testy zazwyczaj przeprowadza się w temperaturze 20-37°C. Ogólnie rzecz biorąc, enzym będzie bardziej aktywny w temperaturze 37°C niż w temperaturze 20°C.
definicja jednostki enzymu byłaby lepiej wyrażona w ten sposób:
1 jednostka (U) to ilość, jeśli enzym katalizuje reakcję 1 nmol substratu na minutę w standardowych warunkach.
Niestety termin”warunki standardowe”jest otwarty na interpretację i mogą istnieć różne preferencje użytkownika, przynajmniej w środowiskach R&D. Tak więc dziesięć różnych laboratoriów badawczych może (całkiem poprawnie) obliczyć różne działania dla tego samego roztworu enzymu. Większość laboratoriów badawczych ustala własne „standardowe warunki” i sprawdza każdą nową partię wewnętrznie. W warunkach klinicznych „warunki standardowe” są wyraźnie zdefiniowane i wszystkie laboratoria muszą przeprowadzać identyczne testy.
opracowywanie testów i znaczenie zakresu liniowego
wartość aktywności (jednostki/ml) dla enzymu jest najważniejszym parametrem podczas opracowywania testu. Dzieje się tak, ponieważ ilość (tj. liczba jednostek), którą dodasz, określi ilość substratu, który zostanie przekształcony w produkt. Pamiętaj, że 1 jednostka katalizuje konwersję 1 nmol substratu na min (definicja B).
Podane jednostki / ml mogą dać przybliżony obraz tego, ile enzymu dodać, ale ponieważ wartość aktywności mogła nie zostać określona w teście identycznym z Twoim, zwykle przygotowuje się seryjne rozcieńczenia enzymu (np. początkowe rozcieńczenia log) i testuje stałą objętość każdego rozcieńczenia. W zależności od sygnału testu (który będzie związany z ilością przekształconego substratu) może być wymagane drugie doświadczenie w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia.
Jakie dokładnie jest „najlepsze” rozcieńczenie? Aby odpowiedzieć na to pytanie, musimy zastanowić się nad najważniejszym aspektem projektowania testu-zakresem liniowym. Ważne jest, aby praca ilościowa działała w zakresie, w którym wykres sygnału testu (często absorbancji) względem stężenia enzymu jest liniowy. Większość testów jest liniowa, jeśli stopień konwersji substratu jest mniejszy niż 15%, przy założeniu, że nie ma innych czynników ograniczających. Poprzez ustalenie czasu testu (np. 30 min) i temperatury (np. 25oC) stopień konwersji można kontrolować po prostu poprzez dostosowanie jednego parametru, tj. liczby dodanych jednostek enzymu.
To jest zilustrowane graficznie na fig.1 z rozcieńczeniami wyrażonymi jako wzajemne (tj. rozcieńczenie 1/10 = 0,1 na osi x). Własny wykres może różnić się kształtem i zakresem liniowym, ale przy bardzo wysokim stężeniu enzymu niewątpliwie sygnał testu nie zwiększy się proporcjonalnie do ilości dodanego enzymu.
test na fig.1 jest liniowy do gęstości optycznej (OD) 2,5, a współczynnik rozcieńczenia 0,02 (1/50 rozcieńczenia enzymu) byłby idealny do pracy testowej, ponieważ daje duży sygnał (~1,5) i leży w środku zakresu liniowego. Obliczenia oparte na wynikach dla współczynników rozcieńczenia w zakresie od 0,04 do 0,12 (tj. region o zmniejszonym zboczu) będą lekceważyć rzeczywisty poziom aktywności enzymu, ponieważ coś wyraźnie ogranicza wielkość sygnału testu.
wiele czynników może działać w celu ograniczenia zakresu liniowego i zakres będzie się różnić w zależności od testu. Jedną z powszechnych przyczyn nieliniowości jest nadmierne zużycie substratu, które może powodować spadek szybkości reakcji, ale ograniczenia elementów optycznych czytnika płyt (lub jakiegokolwiek innego urządzenia pomiarowego) mogą być również znaczące. Na przykład większość czytników płyt nie może wiarygodnie zmierzyć wartości absorbancji powyżej 3 i ograniczenie to będzie miało zastosowanie niezależnie od procentu substratu, który został przekształcony w produkt.
Rys. 1. Absorbancja w stosunku do ilości enzymu
chociaż nie omówiono inaczej w tym przewodniku, należy również mieć świadomość, że enzymy mogą ulegać denaturacji w czasie, zwłaszcza jeśli są bardzo rozcieńczone,a produkty niektórych reakcji mogą hamować enzym. W rzeczywistości istnieją inne możliwe przyczyny nieliniowego zachowania, ale zazwyczaj stosunkowo łatwo jest znaleźć Zakres liniowy metodą prób i błędów przy użyciu seryjnych rozcieńczeń enzymu, jak opisano powyżej.
czas i temperatura
te parametry mogą również wpływać na zakres liniowy, ponieważ wpływają na szybkość konwersji substratu. Na przykład test może być liniowy po 15 minutach, ale po 60 minutach można było spożywać zbyt dużo substratu. W takiej sytuacji trzeba by zmniejszyć ilość enzymu, aby przeprowadzić test przez 60 minut. Te same względy dotyczą temperatury badania, ponieważ może ona również wpływać na szybkość reakcji.
większość ludzi przyjmuje czas testu gdzieś między 15 min a 60 min. Należy unikać bardzo krótkich czasów (np. 2 min), ponieważ niewielkie opóźnienie w zatrzymaniu reakcji doprowadzi do znacznego błędu w obliczeniach aktywności. Ważne jest, aby upewnić się, że odczynniki przechowywane w lodówce lub zamrażarce zostały zrównoważone do właściwej temperatury przed użyciem, a jest to szczególnie ważne, jeśli masz stosunkowo krótki czas testowania.
objętość/czułość testu
z praktycznego punktu widzenia objętość testu jest określona/ograniczona przez materiał zużywalny, którego używasz do testów (np. kuwety, probówki lub mikropłyty). Sygnał dla większości testów enzymatycznych jest proporcjonalny do objętości testu, a próby miniaturyzacji testu (np. w celu oszczędzania odczynników) zwykle prowadzą do niższych sygnałów. Jednak testy absorbancji są często wyjątkiem, a przejście z kuwety 3 ml na mikro kuwetę 1 ml nie zmieni odczytu absorbancji, jeśli szerokość (długość ścieżki) kuwety nadal wynosi 1 cm (tj. światło nadal przechodzi przez tę samą „długość” cieczy). Dzieje się tak, ponieważ absorbancja jest proporcjonalna do długości ścieżki, a nie do objętości próbki.
w testach absorpcji mikropłytek długość ścieżki jest równa głębokości cieczy i możliwe jest miniaturyzowanie bez utraty sygnału poprzez zmniejszenie średnicy studni i utrzymanie stałej głębokości cieczy. Na przykład, płytki 96 studzienek mogą łatwo pomieścić 200ul próbki, ale przy objętości testu 50ul lepiej byłoby użyć płytki 384-studzienkowej, aby zwiększyć długość ścieżki w stosunku do obserwowanej przy 50ul próbce w płytce 96-studzienkowej.
ciągłe testy (pomiar wyglądu produktu w czasie)
większość testów przeprowadza się przez określony czas (testy punktu końcowego), a reakcję zatrzymuje się przez dodanie odczynnika zatrzymującego (np. kwasu). Jednak w ciągłych testach wygląd produktu (rzadziej zużycie substratu) jest rejestrowany w sposób ciągły (np. za pomocą rejestratora map). Stosuje się te same podstawowe zasady; Wykres sygnału w stosunku do czasu dla ustalonej ilości enzymu powinien być liniowy, a szybkość powinna się podwoić, jeśli ilość enzymu jest podwojona. Tak długo, jak badanie jest prowadzone w zakresie liniowym, aktywność odpowiednio rozcieńczonych „niewiadomych” może być dokładnie określona na podstawie początkowych szybkości reakcji mierzonych za pomocą zestawu wzorców.
jakie stężenie substratu należy stosować?
stężenie substratu wpłynie na szybkość reakcji, ale istnieje kilka czynników, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze „właściwego” stężenia. Z praktycznego punktu widzenia jedną z kluczowych kwestii jest ilość produktu, która musi być wygenerowana w celu uzyskania mierzalnego sygnału testu. Ponieważ szybkość reakcji enzymatycznej prawdopodobnie spadnie, gdy więcej niż około 15% substratu ulegnie hydrolizie, początkowe stężenie substratu powinno być na ogół co najmniej 10 razy większe od stężenia produktu, o którym wiadomo, że daje akceptowalny sygnał testowy.
inną kwestią jest Km dla podłoża. Podczas gdy dodanie większej ilości substratu ogólnie oznacza, że zobaczysz wyższe wartości aktywności, zależność nie jest liniowa i koszt substratu może być brany pod uwagę. W tym miejscu prawdopodobnie przydatne jest wprowadzenie klasycznego równania Michaelisa-Mentena:
v = (Vmax S)/(Km + S) ……………. Eqn. (1)
gdzie v jest szybkością, Vmax jest maksymalną możliwą szybkością, S jest stężeniem substratu, a Km jest równe stężeniu substratu, które daje połowę maksymalnej aktywności. Wyprowadzenie tego równania i jego podstawowych założeń można znaleźć w każdej książce tekstowej na temat kinetyki enzymatycznej. Chociaż normalne jest mierzenie, a nie obliczanie szybkości reakcji enzymatycznych, przydatne jest zrozumienie podstawowych zasad do celów projektowania testu.
równanie Michaelisa-Mentena jest przydatne, ponieważ pomaga wybrać odpowiednie stężenie substratu, jeśli Km jest znane.
Gdy S = Km, v = (Vmax S)/2S, tj. v/Vmax = s / 2S = ½.
innymi słowy enzym będzie działał przy 50% jego maksymalnej możliwej szybkości, gdy S=Km.
podstawiając do równania 1 wartości dla S = 10 i Km = 1 widać, że zwiększając stężenie substratu 10-krotnie enzym działa teraz przy ~90% jego maksymalnej możliwej szybkości, zamiast 50%. Oczywiście jest to wyższe, ale nie 10 razy wyższe.
przy bardzo wysokich stężeniach substratu Km w równaniu 1 numerycznie staje się nieistotny, a zmierzona szybkość jest wtedy równa Vmax.
wiele testów przeprowadza się z stężeniem substratu na poziomie lub wokół wartości Km, ale jeśli Km jest bardzo wysoki, może nie być możliwe użycie tak wysokiego stężenia substratu (np. ze względu na koszty lub ograniczoną rozpuszczalność).
w niektórych sytuacjach może być nawet wskazane stosowanie stosunkowo niskiego stężenia substratu. Na przykład w odkrywaniu leków farmaceutycznych zastosowanie bardzo wysokich stężeń substratów utrudniłoby identyfikację kompetycyjnych inhibitorów enzymów (kompetycyjne inhibitory wiążą się z tym samym miejscem co substrat).
należy uzyskać równowagę różnych czynników, aby test miał mierzalny sygnał, mógł być obsługiwany w zakresie liniowym i mógł spełniać wszelkie inne cele testu (np. koszt, Czas i tak dalej).
Standardowe krzywe
standardowa krzywa jest zawsze wymagana, jeśli chcesz obliczyć aktywność enzymu. Nie jest to konieczne, jeśli interesują Cię tylko względne wartości aktywności.
krzywą wzorcową konstruuje się poprzez pomiar sygnału testowego za pomocą standardowych roztworów produktu reakcji w odpowiednim zakresie stężeń. Idealnie powinieneś uruchomić standardową krzywą dla każdego eksperymentu, ale jeśli standardowa krzywa jest wysoce powtarzalna, może być dopuszczalne, aby uruchomić ją okresowo.
typową krzywą standardową przedstawiono na rysunku 2 poniżej. Jest to standardowa krzywa dla testu ATPazy, w którym ATP jest hydrolizowany do ADP i Pi (fosforanu nieorganicznego).
Rys. 2. Standardowa krzywa dla Pi
fosforan wykrywa się za pomocą odczynnika wiążącego barwnik, który zmienia barwę w obecności fosforanu. Jednak specyfika tego testu nie jest tutaj ważna; niezależnie od rodzaju produktu lub metody wykrywania, która jest używana, należy skonstruować standardową krzywą pokazującą zależność sygnału od ilości produktu w teście. „Krzywa” (w idealnym przypadku jest to linia prosta) służy do określenia ilości produktu wytworzonego w próbkach o nieznanej aktywności, tj. z wartości absorbancji, poprzez odczytanie punktu przecięcia na osi X. (Większość pakietów oprogramowania graficznego automatycznie oblicza wartości x z zmierzonych wartości y). Następnie można obliczyć ilość aktywności (patrz później).
czy wykreślić koncentrację lub wartość bezwzględną na osi X?
nie ma tu jednej poprawnej odpowiedzi, a możliwość zastosowania obu metod może często powodować zamieszanie przy obliczaniu wartości aktywności. Na przykład, rysowanie nmol produktu na osi x jest bardzo wygodne, jeśli trzeba obliczyć wartości aktywności (pamiętaj, aktywność = nmol na min na ml). Jednak odczynniki laboratoryjne są zwykle przygotowywane w znanych stężeniach i często łatwiej jest narysować te wartości na osi X. Jednak podczas obliczania aktywności (lub specyficznej aktywności) enzymu należy pamiętać o zamianie stężenia na osi x na liczbę nmoli wytworzonego produktu, co oznacza, że należy wziąć pod uwagę objętość testu. Powód jest łatwy do zrozumienia: 50ul i 100ul objętości roztworu wzorcowego będzie w tym samym stężeniu, ale większa objętość będzie zawierać dwukrotnie więcej produktu. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest wybrać jedno podejście (tj. wykreślić bezwzględną ilość produktu lub stężenie), aby zawsze stosowana była ta sama metoda obliczania aktywności.
kontrole i odejmowanie „pustych” danych
właściwe kontrole są niezwykle ważne dla pracy ilościowej, podobnie jak prawidłowe wykorzystanie danych kontrolnych w obliczeniach.
kontrolki informują (pośrednio), ile sygnału testowego wynika z działania enzymu, a ile z innych powodów. Częstym źródłem „fałszywego” sygnału jest substrat (który często może być zanieczyszczony produktem). Inne składniki testu mogą również dawać mały sygnał w zależności od rodzaju składników i rodzaju testu. Celem kontroli jest umożliwienie usunięcia (poprzez odejmowanie) wszelkich elementów całkowitego sygnału, które nie są związane z działaniem enzymu. Jeśli test jest dobrze zaprojektowany, a odczynniki testowe są dobrej jakości, leczenie kontroli jest zwykle dość proste.
niektóre ogólne wytyczne są podane poniżej:
jeśli wrócimy do testu kolorymetrycznego do wykrywania nieorganicznego fosforanu, możemy podkreślić pewne potencjalne problemy, które są łatwo wykrywane za pomocą odpowiednich kontroli.
odczynnik do wykrywania fosforanów daje niski odczyt około 0,08 w 96 – studzienkowej płytce przy długości fali używanej do pomiaru (około 650 nm).
możemy ustawić następujące testy/kontrole (odczyty w nawiasach w hipotetycznej sytuacji testu):
- wszystkie składniki testu minus enzym (0,5)
- enzym sam w sobie (0,1)
- enzym plus wszystkie inne składniki (1,8)
wyraźnie sygnał testu 1,8 nie wynika wyłącznie z działania enzymu na substrat.
dla każdego testu enzymatycznego kluczową kontrolą (a) jest pominięcie enzymu (i zastąpienie go buforem). Daje to sygnał tła dla wszystkich innych składników testu jako grupy, w tym substratu, który może zawierać niewielką ilość produktu. Ta kontrola nie informuje o sygnale tła dla enzymu, ale wyraźnie nie można dodać enzymu do substratu jako kontroli! W większości testów enzym nie daje sygnału, ponieważ jest znacznie rozcieńczany przed użyciem w teście. Można to łatwo sprawdzić, jak w B powyżej.
dane dla próbki a (powyżej) sugerują, że mieszanina jest zanieczyszczona fosforanem nieorganicznym. Poszczególne komponenty można następnie sprawdzić, aby zidentyfikować źródło problemu. Sytuacja ta jest dość powszechna w przypadku testów Atpaz i innych enzymów wytwarzających fosforany, ponieważ substraty są często niestabilne i są częściowo hydrolizowane, aby uzyskać nieorganiczny fosforan.
poprawienie nieprzetworzonych danych może być niezręczne, jeśli kilka komponentów daje fałszywe sygnały; eliminacja problemu u źródła jest na ogół znacznie lepsza niż jakiekolwiek leczenie matematyczne. „Skorygowana” wartość dla próbki C powyżej może wydawać się równa 1.2 (tj. 1.8 – 0.5 – 0.1) ale ściśle mówiąc jest to złe. Pamiętaj, że płytka testowa i odczynnik detekcyjny dają sygnał tła o wartości około 0,08, więc źródłem większości sygnału dla kontroli a jest plastik płytki i / lub odczynnik detekcyjny. Ten sam mały sygnał musi być również ukryty w wartości dla kontroli enzymu. Tak więc w korekcie zastosowanej powyżej dwukrotnie odejmowaliśmy to Ukryte puste miejsce.
zawsze będziesz musiał odjąć kontrolki od danych testu, i lepiej jest połączyć wszystkie substancje (z wyjątkiem enzymu) i odjąć jedną wartość. W przypadku zastosowania takiego podejścia krzywą standardową traktuje się w ten sam sposób i odejmuje się wartość kontrolną (tj. wartość uzyskaną w przypadku braku produktu, tj. analogiczną do opisanej powyżej próby ślepej z tabliczką/odczynnikiem). Tak więc ani odejmowane dane z testu, ani odejmowana standardowa krzywa nie zawierają potencjalnie mylącego sygnału tła wywołanego przez odczynnik płytki/testu.
wreszcie, jak widzieliśmy, fałszywe sygnały są łatwo wykrywane za pomocą odpowiednich kontroli, ale najlepszą strategią uzyskania dobrej jakości danych jest użycie odczynników o niskim tle, aby wartości kontroli były niskie. Przydatne jest również generowanie sygnału testowego (ze względu na enzym), który jest znacznie wyższy niż jakikolwiek sygnał tła. Idealnie stosunek sygnału do tła powinien wynosić co najmniej 5, a najlepiej 10 lub więcej dla dokładnej pracy ilościowej.
obliczanie wartości aktywności
jest to dość łatwe do zrozumienia, jeśli obliczymy z powrotem na podstawie surowych danych z testu w sposób krokowy. Na przykład, powiedzmy, że wygenerowaliśmy 10nmol produktu w naszej reakcji enzymatycznej (tj. określonej na podstawie standardowej krzywej sygnału w stosunku do bezwzględnej ilości produktu). Ponieważ aktywność jest wyrażona jako nmol na min na ml, musimy wziąć pod uwagę czas i objętość oraz, być może mniej oczywiste, ilość i rozcieńczenie enzymu w celu obliczenia aktywności.
Jeśli test trwa 10 minut, liczba nmol na minutę w powyższym przykładzie wynosi 1. (Krok 1)
Jeśli objętość testu wynosi 200ul, musimy pomnożyć przez 5 (tj. (Krok 2)
wartość ta odnosi się do aktywności enzymu w teście, a nie do próbki enzymu użytego do utworzenia testu. W celu określenia aktywności enzymu w oryginalnej próbce enzymu potrzebne są dodatkowe czynniki korygujące.
enzym mógł zostać rozcieńczony przed użyciem i musi być dalej rozcieńczony przez inne składniki obecne w teście. Jeśli test (w sumie 200ul) zawiera 20ul enzymu, a enzym jest wstępnie rozcieńczony 1/100 przed dodaniem próbki 20ul, prawdopodobnie widać, że powinniśmy najpierw pomnożyć przez 10 (Krok 3), a następnie przez 100 (krok 4), Aby uzyskać aktywność enzymu w oryginalnym roztworze enzymu.
do tej pory jest to stosunkowo proste. Wspomnieliśmy jednak wcześniej, że koncentracja jest często wykreślana na osi X krzywej standardowej. W ten sposób wartości mogą być wyrażone w MM (nie mmol) i nie można określić liczby mmol po prostu sprawdzając krzywą standardową.
ponieważ mM oznacza mmole na litr, mamy rozbieżność między domniemaną objętością 1L a rzeczywistą objętością testu. Tak więc, jeśli mamy produkt 10 mm, a objętość testu wynosi 200ul, musimy podzielić przez 5000, aby uzyskać liczbę mmoli produktu.
możesz zauważyć, że dzielenie przez 5000 tutaj kompensuje niektóre operacje mnożenia, które były wymagane powyżej. Rzeczywiście, jest to całkiem normalne dla współczynników korekcyjnych, aby się anulować. Na przykład, w 10-minutowym teście z użyciem 1/10 rozcieńczonego enzymu, podzielisz przez 10, aby uzyskać nmol na minutę, a następnie pomnożysz przez 10, aby skorygować współczynnik rozcieńczenia.
wynika z tego, że jeśli zawsze stosujesz standardowe warunki testu (tj. twój standard), będziesz mógł pomnożyć wartość ” x ” z krzywej standardowej przez pojedynczy globalny współczynnik korekcji, który obejmuje wszystkie inne indywidualne Współczynniki korekcji, aby obliczyć wartości aktywności. Tylko przy pierwszej okazji trzeba zidentyfikować poszczególne czynniki korekcyjne.
hamowanie enzymów/badania przesiewowe leków
jest to obszar enzymologii, w którym nadal istnieje potrzeba działania w zakresie liniowym, ale gdzie obliczenia wartości aktywności zwykle nie są istotne; raczej względna szybkość reakcji (lub względna ilość wytworzonego produktu) w obecności i braku substancji badanej jest kluczowa, co wymaga niewiele więcej niż prostych obliczeń przy użyciu ślepych odejmowanych danych z testu. Po odjęciu półfabrykatów ilość wytworzonego produktu wyraża się jako procent ilości otrzymanej w przypadku braku substancji badanej (tj. 100%). Testy te mogą być czasami prowadzone z dość niskim stosunkiem sygnału do tła, ponieważ pojawia się pytanie – czy substancja testowa hamuje reakcję?
– wymaga tylko odpowiedzi tak/nie.
podsumowanie
Ten przewodnik zawiera jasne wyjaśnienia dotyczące „jednostek enzymu”, „aktywności enzymu” i „specyficznej aktywności enzymu” oraz definicji jednostek i znaczenia „zakresu liniowego”. Specyfika tego, co wykreślić na osi X standardowych krzywych, zależy od preferencji użytkownika, ale przy obliczaniu działań wymagana jest pewna ostrożność. Kontrole testów są ważne, ale stosowanie wysokiej jakości odczynników jest lepsze niż usuwanie tła przy użyciu metod matematycznych. Wysoki stosunek sygnału do tła jest pożądany do pracy ilościowej, a wiele parametrów można zmieniać w celu zwiększenia sygnału testu; nie zawsze jest konieczne po prostu dodanie więcej enzymu. Wartości aktywności enzymów można łatwo obliczyć, jeśli do identyfikacji kluczowych zmiennych testu stosuje się podejście stopniowe.
Zobacz więcej protokołów i przewodników