Identyfikacja Bordetella pertussis u krytycznie chorego pacjenta zakażonego ludzkim wirusem niedoboru odporności poprzez bezpośrednią analizę Genotypową materiału barwionego gramami i dyskryminację z B. holmesii za pomocą unikalnego miejsca enzymu restrykcyjnego genu recA

identyfikacja bakterii z próbek klinicznych odbywa się głównie poprzez charakterystykę fenotypową po hodowli in vitro i mikroskopii. Nierzadko jednak bezpośrednie preparaty gramowe ujawniają wiele organizmów, jednak kultury nie wykazują patogenu. Zostało to zilustrowane w niedawnym przypadku klinicznym, w którym 48-letni mężczyzna z AIDS został przyjęty z kokcydioidomikozą płuc. Pomimo terapii przeciwgrzybiczej jego stan nie poprawił się. Próbki plwociny ujawniły wiele Gram-ujemnych prątków w bezpośrednim mikroskopie, ale brak patogenów w hodowli. Ponadto w kilku hodowlach krwi wyhodowano pręty gram-ujemne, których nie można było wyhodować metodami konwencjonalnymi.

zdecydowaliśmy się na próbę identyfikacji dwóch izolatów metodami genotypowymi przy użyciu uniwersalnych starterów oligonukleotydowych skierowanych na mały Gen podjednostki rRNA (16S rRNA). Z próbek oddechowych dostępne były jednak tylko szkiełka barwione w gramach. Dlatego opracowaliśmy nową metodę, w której DNA bakterii jest odzyskiwane bezpośrednio z szkiełka barwionego gramami. Szkiełka były barwione metodą tradycyjną (12). Szkiełko z przezroczystego szkła posmarowano próbkami i potraktowano absolutnym metanolem (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), następnie utrwalanie termiczne w temperaturze 65°C i obróbka roztworem fioletu krystalicznego (Remel, Lenexa, Kans.). Szkiełko poddano dalszej obróbce jodem grama (Remel), odbarwiono roztworem alkoholu-acetonu (3:1) i przeciwstawiono safraniną (Remel). Olej zanurzeniowy najpierw usunięto ze szkiełka za pomocą 100% ksylenu (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.), a następnie przepłukano w 100% etanolu. Następnie materiał został złomowany prostą żyletką, zawieszoną w 50 µl roztworu hydratacji Puregen-DNA (Gentra, Minneapolis, Minn.), wirować i gotować przez 10 min. Do analizy izolatu krwi użyto materiału zarówno z butelki BACTEC, jak i z Kolonii hodowanych na stałym podłożu. Następnie przeprowadzono PCR w objętości 50 µl zawierającej 5 µl szablonu, 1,5 mM MgCl2, 100 µM każdy trifosforan deoksynukleozydu (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U polimerazy DNA TAQ (Roche Diagnostics Corporation) i 0,15 µM (każdy) uniwersalnych starterów 16S rRNA 11E (5′-GAGGAAGGGGGGATGACG-3′) i 13B (5′-TCCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′), jak opisano wcześniej (15). Po etapie denaturacji trwającym 5 minut w temperaturze 94°C, stopnie PCR wynoszące 94°C przez 60 s, 50°C przez 60 s I 72°C przez 90 s powtórzono 30 razy w systemie PCR Perkin-Elmer GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Produkty otrzymano zarówno z plwociny, jak i z krwi (Fig. 1). Oczyszczono je za pomocą zestawu qiaquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Valencia, Calif.), a sekwencjonowanie DNA przeprowadzono na Sekwencerie Applied Biosystems ABI3100 (HHMI biopolimer / W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School Of Medicine). Późniejsze porównanie z publiczną bazą danych (GenBank) przez BLAST (1) zidentyfikowało izolat krwi jako Helicobacter cinaedi lub Helicobacter rappini. Oba organizmy były związane z bakteremiami u pacjentów z obniżoną odpornością(9, 10, 13, 16, 17). Produkt PCR izolatu oddechowego pasował do genów 16S rRNA zarówno Bordetella pertussis, jak i Bordetella holmesii, które są w 99,5% homologiczne i identyczne w regionie amplifikowanym (18).

w celu specjalizacji izolatu układu oddechowego Bordetella i potwierdzenia wyniku analizy genotypowej opracowano test dyskryminujący, w którym ukierunkowano część genu recA (6, 7), która zawiera unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego. Amplification of B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) I B. holmesii (ATCC 51541) DNA, a także z barwienia plwociny naszego pacjenta przeprowadzono zgodnie z opisem powyżej, z wyjątkiem 3 mM MgCl2 i nowo zaprojektowanych specyficznych starterów (forward, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGG-3′; i odwrotnie, zastosowano 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3′), a stopnie PCR (94°C dla 30 s, 59°C dla 30 s I 72°C dla 60 s) powtórzono 45 razy, a następnie końcowy etap wydłużenia w temperaturze 72°C. Produkty trawiono za pomocą NciI zgodnie z zaleceniami producenta (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.). Te dwa organizmy można łatwo odróżnić, ponieważ B. holmesii ma dwa miejsca NciI, podczas gdy B. pertussis i wszystkie inne Bordetella spp. mają tylko jedno miejsce NciI w regionie amplifikowanym. Izolat plwociny został następnie zidentyfikowany jako B. krztusiec (Fig. 2) i był opisywany jako oportunistyczny patogen płuc u pacjentów zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (4, 5).

następnie zbadaliśmy, czy genotypowa identyfikacja organizmów bezpośrednio z klinicznych preparatów barwiących gram z uniwersalnymi starterami jest wykonalną i powtarzalną metodą. Rodzaj utrwalania (ciepło, 100% metanol i 100% etanol) i obecność pozostałości barwnika po barwieniu grama, jak opisano powyżej, nie zakłócają PCR. Stwierdzono granicę wykrywalności 1500 CFU/µl plwociny (od 6 do 30 organizmów na pole zanurzeniowe oleju), co jest podobne do innych doniesień (14). W tym celu połączono trzy przypadkowe próbki plwociny klinicznej bez bakterii na plamie grama lub w hodowli, doprawiono określonymi ilościami Escherichia coli (ATCC 25922), utrwalono i zabarwiono grama i zeskrobano szkiełko, jak opisano powyżej. Zbadano kilka losowo wybranych próbek klinicznych, a gdy dominujący organizm był widoczny w mikroskopie, jego identyfikacja była zgodna z hodowanym patogenem (Tabela 1).

nasza metoda ma kilka zalet w stosunku do wcześniej opisanych testów. W przeciwieństwie do poprzednich doniesień, w których DNA jest najpierw ekstrahowane z plwociny i stosuje się startery specyficzne dla gatunku(2, 11, 14, 19, 20), nasz test wykorzystuje DNA odzyskane bezpośrednio ze szkiełek barwionych gramami bez etapów ekstrakcji i wykorzystuje uniwersalne startery, umożliwiając w ten sposób identyfikację szerokiej gamy bakterii za pomocą prostego protokołu. Jak pokazano, Można to osiągnąć nawet w obecności normalnej flory rezydującej w tle, ponieważ liczba cykli PCR jest ograniczona, co pozwala na konkurencyjną amplifikację DNA bakterii. Ponieważ jakość przedstawionej próbki i względne proporcje morfologicznie różnych drobnoustrojów można łatwo określić na plamach gramowych, odpowiednie rozmazy można wybrać przed amplifikacją DNA. Ponadto pojawienie się plam gramowych dominującego organizmu służy jako wewnętrzna kontrola jakości po identyfikacji genotypowej. Podobnie jak w przypadku identyfikacji fenotypowej, wyniki naszego testu muszą być skorelowane z obrazem klinicznym przed podjęciem decyzji o leczeniu, ponieważ żadna z metod nie może niezawodnie odróżnić kolonizacji i infekcji.

wśród nielicznych doniesień w literaturze anglojęzycznej opisujących odzyskiwanie kwasu nukleinowego z próbek klinicznych na szkiełkach szklanych (3, 8), jak dotąd żaden nie opisał amplifikacji DNA po odzyskaniu bakterii z szkiełek barwionych gramami. Nasza metoda jest szybka i niezawodna i może być stosowana jako narzędzie w przypadkach, w których organizmy są widoczne w obfitości na szkiełkach klinicznych, ale nie mogą być odzyskane w kulturze. Technika ta może być szczególnie przydatna, gdy diagnoza jest poszukiwana retrospektywnie lub po odrzuceniu oryginalnych próbek.

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology