Wysokosprawna chromatografia cieczowa spektrometria mas jest niezwykle wszechstronną techniką instrumentalną, której korzenie tkwią w zastosowaniu bardziej tradycyjnej chromatografii cieczowej do teorii i oprzyrządowania, które zostały pierwotnie opracowane dla chromatografii gazowej (GC). Jak sama nazwa wskazuje, oprzyrządowanie składa się z wysokosprawnego chromatografu cieczowego (HPLC) podłączonego za pośrednictwem odpowiedniego interfejsu do spektrometru masowego (MS). Główną zaletą HPLC / MS nad GC / MS jest to, że jest w stanie analizować znacznie szerszy zakres komponentów. Związki, które są termicznie labilne, wykazują wysoką polaryzację lub mają wysoką masę cząsteczkową, mogą być analizowane przy użyciu HPLC/MS, nawet białka mogą być rutynowo analizowane. Roztwory pochodzące z interesujących próbek są wstrzykiwane do kolumny HPLC, która zawiera wąską rurę ze stali nierdzewnej (zwykle o długości 150 mm i średnicy wewnętrznej 2 mm lub mniejszej) wypełnioną drobnymi, chemicznie modyfikowanymi cząstkami krzemionki. Związki są rozdzielane na podstawie ich względnej interakcji z powłoką chemiczną tych cząstek (Faza stacjonarna) i rozpuszczalnikiem eluującym przez kolumnę (Faza ruchoma). Składniki eluujące się z kolumny chromatograficznej są następnie wprowadzane do spektrometru masowego za pośrednictwem specjalistycznego interfejsu. Dwa najczęściej używane interfejsy HPLC / MS to jonizacja elektroopryskowa i jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym.
jonizacja Elektrospray
w jonizacji elektrospray analit jest wprowadzany do źródła przy natężeniach przepływu zwykle rzędu 1µl min-1. Przepływ roztworu analitu przechodzi przez igłę electrospray, która ma wysoką różnicę potencjałów (w odniesieniu do elektrody przeciwnej) nałożoną na nią (zwykle w zakresie od 2,5 do 4 kV). Wymusza to rozpylanie naładowanych kropelek z igły z ładunkiem powierzchniowym o tej samej polaryzacji do ładunku na igle. Krople są odpychane z igły w kierunku stożka pobierania próbek źródła na elektrodzie licznika (pokazanej na niebiesko). Gdy krople przemierzają przestrzeń między końcówką igły a stożkiem, następuje odparowanie rozpuszczalnika. To jest Zakreślone na rysunku.1 i powiększony na Fig.2. Gdy następuje odparowanie rozpuszczalnika, kropla kurczy się, dopóki nie osiągnie punktu, w którym napięcie powierzchniowe nie może już utrzymać ładunku (granica Rayleigha), w którym następuje „eksplozja Kulombiczna” i kropla jest rozrywana. W ten sposób powstają mniejsze kropelki, które mogą powtórzyć proces, jak również nagie naładowane cząsteczki analitu. Te naładowane cząsteczki analitu (nie są ściśle jonami) mogą być pojedynczo lub mnożyć naładowane. Jest to bardzo miękka metoda jonizacji, ponieważ podczas jonizacji analit zatrzymuje bardzo mało energii resztkowej. Jest to wytwarzanie wielokrotnie naładowanych cząsteczek, które umożliwia analizę składników o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak białka, ponieważ zakres mas spektrometru masowego jest znacznie zwiększony, ponieważ faktycznie mierzy stosunek masy do ładunku, a nie masy per se. Główną wadą tej techniki jest to, że bardzo mało (zwykle nie) fragmentacja jest wytwarzana, chociaż można to przezwyciężyć poprzez zastosowanie tandemowych technik spektrometrii masowej, takich jak MS/MS lub MSn.
Rysunek 1 Schemat interfejsu ESI
Rysunek 2 Schemat mechanizmu powstawania jonów
jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym
jonizacja (APCI) jest analogiczną metodą jonizacji do jonizacji chemicznej (Ci). Istotną różnicą jest to, że APCI Występuje pod ciśnieniem atmosferycznym i ma swoje podstawowe zastosowania w obszarach jonizacji związków o niskiej masie (APCI nie nadaje się do analizy związków termicznie labilnych). Ogólne ustawienie źródła (patrz Rys. 3) wykazuje silne podobieństwo do ESI. Gdzie APCI różni się od ESI, jest w sposobie jonizacji. W ESI jonizacja jest kupowana przez różnicę potencjałów między igłą natryskową a stożkiem wraz z szybkim, ale delikatnym desolvatem. W APCI roztwór analitu jest wprowadzany do rozpylacza pneumatycznego i desolwatowany w ogrzanej rurce kwarcowej przed interakcją z wyładowaniem koronowym, tworząc jony. Wyładowanie koronowe zastępuje włókno elektronowe w CI-ciśnienie atmosferyczne szybko „wypaliłoby” wszelkie włókna – i wytwarza pierwotne N2°+ i N4°+ przez jonizację elektronową. Te pierwotne jony zderzają się z odparowanymi cząsteczkami rozpuszczalnika, tworząc wtórne reagujące jony gazowe – np. H3O+ i (H2o)nH+ (patrz Fig. 4). Te reagujące jony gazu następnie ulegają wielokrotnym zderzeniom z analitem, w wyniku czego powstają jony analitu. Wysoka częstotliwość kolizji skutkuje wysoką skutecznością jonizacji i termalizacji jonów analitu. Powoduje to powstawanie widm głównie molekularnych i adduktujących jonów o bardzo małej fragmentacji. Po uformowaniu jonów wchodzą one w etap pompowania i skupiania w taki sam sposób jak ESI.
Rysunek 3 Schemat składników źródła APCI
Rysunek 4 bardziej szczegółowy widok mechanizmu APCI
diagramy i tekst (częściowy) dr Paul Gates, Szkoła of Chemistry, University of Bristol