pojawienie się biologii tlenowej zostało zwiastowane około dwóch miliardów lat temu, kiedy prymitywne cyjanobakterie wyewoluowały zdolność do fotooksydacji wody. Tlen został uwolniony jako produkt odpadowy, a atmosferyczny poziom O2 szybko wzrósł. Ta szybka zmiana w atmosferze tlenowej wprowadziła niszczące zanieczyszczenia, ale ostatecznie ewoluowały organizmy, które wykorzystywały silną siłę napędową redukcji O2. Enzymatyczne miejsca aktywne, które były zdolne do wiązania i aktywowania tlenu, ewoluowały i możliwe stały się nowe klasy biochemii, które wykorzystują O2 jako termodynamiczny zlew do kierowania niekorzystnymi reakcjami. Wydajność metabolizmu żywności zmieniła się dramatycznie. Ilość ATP, która może być wytwarzana przez metabolizm glukozy, na przykład, wzrosła prawie 20-krotnie. Eukarioty pojawiły się wkrótce po atmosferze tlenowej i ostatecznie po nich pojawiły się różnorodne organizmy wielokomórkowe, które istnieją dzisiaj. W naszej biochemii tlenowej O2 jest używany w wielu syntetycznych reakcjach, które są fundamentalne dla prawie wszystkich aspektów wzrostu, rozwoju i reprodukcji komórek.
pomimo swojej biochemicznej wszechstronności, jednak>95% tlenu, który spożywamy, jest wykorzystywane w oddychaniu. Wysokoenergetyczne elektrony pochodzące z pożywienia przemierzają mitochondrialny łańcuch transportu elektronów w serii egzergonicznych reakcji redoks. Te energicznie obniżające się transfery elektronów są wykorzystywane do opracowania chemisosmotycznego gradientu protonu, który ostatecznie wytwarza ATP. Tlen jest końcowym akceptorem elektronów w tej kaskadzie oddechowej, a jego redukcja do wody jest używana jako nośnik, za pomocą którego można oczyścić łańcuch mitochondrialny z niskoenergetycznych, zużytych elektronów. Enzym, który katalizuje ten proces, oksydaza cytochromu, obejmuje błonę mitochondrialną. Wiąże, aktywuje i redukuje do 250 cząsteczek O2 na sekundę i łączy energię uwolnioną w tym procesie z translokacją protonów, które przyczyniają się do gradientu chemiosmotycznego. Mechanizm, za pomocą którego oksydaza cytochromowa katalizuje tę niezwykłą chemię, był intensywnie badany. Wyniki przedstawione w tym wydaniu przez Fabiana, Wonga, Gennisa i Palmera zapewniają nowy wgląd w ten proces i wspierają rosnące przekonanie, że istnieją koncepcje ujednolicające sposób, w jaki enzymy wykorzystujące tlen aktywują O2 w celu rozszczepienia i redukcji wiązania O⩵O (1).
redukcja O2 w oksydazie cytochromu następuje przy poważnych ograniczeniach. Proces odbywa się z niewielką nadpotencjałem, uwalnianie częściowo zredukowanych, toksycznych półproduktów tlenu z miejsca aktywnego jest zminimalizowane, a wolna energia dostępna w redukcji O2 jest sprzężona z wysoką wydajnością z translokacją protonów (2, 3). Enzym działa pod tymi ograniczeniami, używając hemu Fe, zwanego hem a3, i jonu miedzi, zwanego CuB, w centrum dwujądrowym, w którym O2 wiąże się i jest redukowany(patrz Fig. Fig.1).1). Wejście elektronów do tego miejsca następuje z cytochromu c za pomocą drugiego hemu żelaza, hemu a i drugiego centrum miedzi, CuA. Niedawno Grupa Yoshikawy (4) i grupa Michela (5) niezależnie i jednocześnie dostarczyły struktur krystalicznych enzymu, które dały głęboki wgląd w wiele aspektów cyklu katalitycznego, w szczególności w to, jak protony i tlen mogą przemieszczać się przez białko. Mechanizm redukcji O2 przez oksydazę był realizowany przez wiele grup z różnymi technikami spektroskopowymi (recenzje, patrz refs. 6 i 7). Na podstawie tej pracy uproszczoną sekwencję reakcji, która obejmuje przejściowe, ale wykrywalne, półprodukty w centrum dwujądrowym, można zapisać w następujący sposób (patrz także Fig. Fig.2): 2):
gatunki P i F, w szczególności, przyciągnęły uwagę, ponieważ zostały zaangażowane w mechanizm pompowania, który napędza translokację protonów (8). Ostatnie prace Michela (9) oraz Wikströma i współpracowników (10) podkreśliły zarówno postęp, jak i niepewność w naszym zrozumieniu mechanizmu, który łączy egzergoniczne transfery elektronów do tlenu z endergonicznym ruchem protonów przez membranę.
Ośrodek dwujądrowy w oksydazie cytochromu. Hem a3 i CuB są pokazane wraz z bliższym ligandem żelaza hemu, H376 i ligandem CuB, H240, który jest usieciowany z Y244 (24, 25). Wiązanie i redukcja O2 występuje w obszarze między żelazem A3 a CuB.
uproszczony schemat reakcji między oksydazą cytochromu i O2. Pokazano miejsce dwujądrowe, które zawiera hem a3, CuB i usieciowaną strukturę H240-Y244 (H-Y). Redukcja i protonacja utlenionej formy ośrodka powoduje zmniejszenie miejsca. Wiąże To O2, tworząc początkowo gatunek oxy, który reaguje dalej, tworząc półprodukty P I F, przed regeneracją utlenionej formy enzymu. Redukcja P I F jest ograniczona przez reakcje przenoszenia protonów, jak wskazano. Etapy pomiędzy P A zredukowaną formą miejsca są związane z procesami pompowania protonów, które są oznaczone czerwonymi strzałkami. Stechiometria tych etapów jest obecnie przedmiotem badań, chociaż podczas pełnego cyklu można pompować do czterech protonów.
ciągłym problemem w rozwikłaniu chemii tlenu w centrum dwujądrowym w oksydazie cytochromu i jej związku z pompą protonową jest ustalenie struktur molekularnych półproduktów w powyższym schemacie. Istnieje konsensus, że półprodukt F obejmuje półprodukt ferrylo-okso w Hem a3, a34 + ⩵O (3, 6, 11, 12), struktura P była jednak przedmiotem spornych kontrowersji. Początkowe przypisania tego gatunku postulowały, że zawiera on Wiązanie nienaruszone, A33 + – O2⩵ gatunków, stąd jego oznaczenie jako P dla „peroxy”(np., refs. 3, 8 i 13). Weng i Baker zinterpretowali jednak swoje dane optyczne, wskazując, że rozszczepienie wiązania O⩵O miało już miejsce na P i że ten gatunek również miał strukturę A34+⩵O w centrum dwujądrowym (14). Wniosek ten został następnie poparty kilkoma badaniami spektroskopowymi (15-17). Kitagawie, Proshlyakovowi i współpracownikom udało się użyć spektroskopii Ramana do wykrycia ruchu rozciągającego a34+⩵O (18, 19) w postaci P generowanego przez dodanie nadtlenku do utlenionego enzymu. Późniejsze prace wykazały, że te same wibracje można zaobserwować, gdy tlen jest dodawany do dwuelektronowej formy enzymu, co potwierdza, że chemia tlenu i chemia nadtlenku w oksydazie przebiegają przez wspólne półprodukty (20). Ponadto przebieg czasowy pojawienia się P w tej pracy wykazał, że gatunek ten jest kompetentny kinetycznie (Zobacz też refs. 21 i 22). Tak więc, z pracy spektroskopowej, a także z niedawnych prac obliczeniowych (23), wyłania się pogląd, że P jest rzeczywiście gatunkiem o⩵O wiązanym.
prace zgłoszone przez Fabian et al. (1) dostarcza nowych, niezależnych i przekonujących dowodów na to, że Wiązanie O⩵O jest rozszczepiane w oksydazie cytochromu na poziomie P. W swoich eksperymentach stwierdzili, że żaden atom tlenu w nienaruszonej wiązaniu strukturze nadtlenowej nie może wymieniać się z wodą rozpuszczalnikową. Jeśli jednak P występuje jako gatunek a34 + ⩵O, to oczekuje się, że drugi atom tlenu znajduje się prawdopodobnie na poziomie wodorotlenku lub wody i że tlen ten może dobrze wymieniać się z wodą w buforze wodnym. Używając 18o2 jako substratu w buforze wodnym, który zawierał H216O, uwięzili półprodukt P i zbadali wygląd H218O. Ich wyniki spektrometrii masowej pokazują wyraźnie, że pojedynczy atom tlenu z substratu 18O2 jest wymienny z wodą rozpuszczalnikową, w doskonałej zgodzie z powyższą analizą i przypisaniem P jako wiązanego, ferrylo-okso gatunku.
świadomość, że p ma strukturę a34+⩵O ma wiele ważnych implikacji. Transformacja związanego O2 w tlenku do wodorotlenku (lub wody)i ferrylo-okso w P wymaga w sumie czterech elektronów. Tylko trzy, jednak, są łatwo dostępne w centrum dwujądrowym-dwa z hemu a3, jak idzie od + 2 do + 4 stanu walencyjnego i jeden z CuB, jak to jest utlenione z miedzi do miedzi. Źródło czwartego elektronu jest niejasne. Utlenianie makrocyklu hemu, jak to ma miejsce w związkach I w niektórych peroksydazach, można wyeliminować na podstawie danych Ramanowych i optycznych (6, 7), a Cu3+ nie został wykryty w środowisku biologicznym. Najbardziej prawdopodobnym kandydatem jest łańcuch boczny białka aktywnego redoks, jak to ma miejsce w peroksydazie cytochromu c, w której tryptofan jest aktywny redoks, lub w syntazie prostaglandyn, która zawiera utlenialną resztę tyrozyny (24). Yoshikawa i współpracownicy (25) dostarczyli uderzających dowodów krystalograficznych, które silnie wspierają występowanie łańcucha bocznego aktywnego redoks. Wykazali, że Y244 w centrum dwujądrowym jest usieciowany z jednym z ligandów CuB, H240, i że grupa główki fenolu jest zorientowana tak, że grupa-OH kieruje się bezpośrednio do jamy wiążącej O2 (Fig . (Rys.1).1). Michel przedstawił podobne dane krystalograficzne (26), a Buse i współpracownicy niedawno przekazali dane biochemiczne, które potwierdzają występowanie sieciowania H240-Y244 (27). Niedawne dane EPR również zostały zgłoszone, że wskazują na obecność rodników tyrozylu, gdy nadtlenek jest dodawany do enzymu spoczynkowego, chociaż nie zidentyfikowano specyficznych łańcuchów bocznych(s) zaangażowanych (28, 29). Wyniki te sugerują, że usieciowana tyrozyna jest źródłem czwartego elektronu w aktywacji i redukcji O2 przez oksydazę cytochromu. To przypuszczenie prowadzi do uproszczonego cyklu reakcji na Fig. Fig.2,2, w którym wyraźnie pokazano usieciowaną strukturę H-Y i zaproponowano utlenianie do obojętnego rodnika tyrozylu w pośrednim P.
schemat na Rys. Fig.22 podkreśla analogie między oksydazą cytochromu a peroksydazami i katalazami pod względem chemii rozszczepiania wiązań tlen-tlen oraz pod względem produktów, które powstają w reakcji. W oksydazie enzym wyodrębnia trzy elektrony z metali w miejscu aktywnym i czwarty elektron z ugrupowania organicznego w celu zmniejszenia O2 w jednym kroku do O⩵ I OH—. Oba te produkty znajdują się na poziomie wody, chociaż dalsze protonowanie i uwalnianie następuje dopiero w późniejszych etapach reakcji. W peroksydazach i katalazach enzym ekstrahuje jeden elektron z metalu w miejscu aktywnym i drugi elektron z ugrupowania organicznego w celu zmniejszenia H2O2 w jednym kroku do O⩵ I OH—. W peroksydazach i katalazach bezpośrednim produktem tej chemii jest związek I, który zawiera gatunek ferrylo-okso i rodnik organiczny. Struktury te są dokładnie analogiczne do struktury A34 + ⩵O/Rodnik, który występuje w P w oksydazie cytochromu. Organiczny Rodnik w związku I jest redukowany w kolejnym etapie w enzymach peroksydazy i katalazy w celu wytworzenia związku II, który utrzymuje strukturę ferrylo-okso. W oksydazie ta sama chemia zachodzi w celu wytworzenia półproduktu F. Podobieństwo w chemii białek hemu metabolizujących tlen pojawiło się dopiero wraz z realizacją struktury A34 + ⩵O dla P i sugeruje, że inne enzymy metabolizujące tlen mogą podążać za tym samym rodzajem chemii w aktywacji i redukcji tlenu i nadtlenków.
z Rys. Fig.22 pod względem tego, jak oksydaza łączy chemię tlenu z pompą protonową. Etapy pompowania występują dopiero po utworzeniu P (8-10), co oznacza, że enzym najpierw aktywuje i redukuje O2 do całkowicie zredukowanych, ale niekompletnie protonowanych cząsteczek wody produktu; enzym uzupełnia czterostronowy transfer elektronów do tlenu i przechowuje wolną energię, która powoduje silnie utlenianie a34 + ⩵O i rodników, przed uruchomieniem pompy. Ostatnie obliczenia dotyczące chemii wiązania-rozszczepiania potwierdzają tę ideę, ponieważ wyniki wskazują, że redukcja O2 do okso i hydrokso z utworzeniem rodnika i ferrylo-okso jest zbliżona do termoneutralnego (23). Stanowi to niezwykle skuteczną strategię unikania toksycznych, częściowo zredukowanych form tlenu, ponieważ żaden z nich nie występuje w cyklu reakcji. Co więcej, przenosząc darmową energię, która zostanie wykorzystana do napędzania pompy z substatowych produktów tlenu do białka, wydaje się, że oksydaza zmaksymalizowała kontrolę i wydajność, z jaką może obsługiwać urządzenie do translokacji protonów.