PMC

podczas translokacji fazy elongacji syntezy białek, mRNA jest rozwijany przez jeden kodon, sprzężony z ruchem Trna z miejsc rybosomalnych a (aminoacyl) do p (peptydyl) i p do E (exit), w procesie katalizowanym przez współczynnik elongacji EF-g (1). Po pierwsze, Trna przemieszczają się na podjednostce 50S do Stanów hybrydowych P/E i A/P, po czym następuje ruch pętli macierzystych Trna anticodon (ASL) z podjednostek A I P 30S do miejsc p i e, odpowiednio, sprzężonych z ruchem powiązanych z nimi kodonów mRNA (2). Pierwszym etapom towarzyszy rotacja intersubunitów (3-7), podczas gdy drugi etap wymaga EF-G·GTP i obejmuje rotację domeny głowy podjednostki 30s (8-11). Chociaż wiele ostatnio dowiedzieliśmy się o strukturalnych podstawach ruchu P-tRNA do strony E(9, 10, 12, 13), półprodukty translokacyjne zawierające a-tRNA są trudniejsze do wychwycenia. Tak więc, większość naszego myślenia o strukturalnych podstawach ruchu a-tRNA i mRNA opiera się na strukturach krystalicznych EF-g związanych z pustymi (14) lub zawierającymi P-tRNA kompleksami rybosomów uwięzionymi w klasycznych (15) lub stanach hybrydowych (10, 12, 13) i dwóch strukturach krio-EM kompleksów rybosomu-EF-g 70s zawierających dwa Trna związane w Stanach hybrydowych P/E i A/P* (16) lub w chimerycznych Stanach hybrydowych ap/P i pe/E (11).

tutaj zgłaszamy strukturę krystaliczną półproduktu translokacyjnego rybosomu 70s zawierającego EF-g, mRNA i dwa Trna – deacylowany tRNA związany w stanie pe/E i peptydyl-tRNA uwięziony w chimerycznym stanie hybrydowym ap / ap. Kompleks powstał z rybosomów T. thermophilus 70s, 39-nukleotydowego mRNA, trnawetu elongatorowego w miejscu P I N-acetylo-Val-trnavalu w miejscu A. Aby zatrzymać półprodukt translokacyjny, dodaliśmy neomycynę, aby zablokować zakończenie translokacji, i kwas fusydowy, aby zapobiec uwalnianiu EF-G (metody uzupełniające; Fig. S1). Strukturę rozwiązano za pomocą danych dyfrakcyjnych do 3,8 Å uzyskanych z Pojedynczego Kryształu (tabela S1). Przykłady gęstości elektronów przedstawiono w materiałach uzupełniających (Fig. S2-S13). W stosunku do rybosomu w stanie klasycznym (17), Głowa podjednostki 30s podlega dużemu obrotowi 21° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, a ciało 30s obrót o 2,7° w stosunku do podjednostki 50S (Fig. 2A, B). P-tRNA anticodon stem-loop (ASL) porusza się z głową 30S w pozycji między miejscem P głowy 30s a miejscem E ciała 30s (stan chimeryczny pe; 1D, E), podczas gdy jego koniec akceptora przesuwa się całkowicie w miejsce 50S E (Fig.1C), tworząc chimeryczny stan Hybrydowy pe/E (9-11). A-tRNA ASL porusza się w ~ 4Å elementów P-site ciała 30s (rys. 1D); jego łokieć obraca się w kierunku klasycznego miejsca 50s P, ale jego koniec akceptora jest związany między podjednostkami A I P 50s (rys. 1C), tworząc chimeryczny stan Hybrydowy ap / ap. Duży, zależny od EF-G obrót głowicy 30s w naszej konstrukcji repozycjonuje helisę H38 z 23s rRNA, umożliwiając łokciu a-tRNA osiągnięcie położenia łokcia Trna w miejscu P (rys. S14). Domena IV EF-G jest zaklinowana w miejscu konwergencji kodonu mRNA w miejscu a, pętli antymodonowej ap / ap tRNA oraz 16S i 23s rRNA na mostku intersubunit B2a, jednocześnie kontaktując się ze wszystkimi czterema RNA (Fig. S15).

chociaż obrót głowy 30s wyraźnie ułatwia translokację ASL w miejscu P (9-11), ASL w miejscu A jest translokowany przez inny mechanizm. P-site ASL porusza się precyzyjnie z obrotem głowy 30s do stanu pe / E, podczas gdy a-site ASL przesunął się dalej niż ruch obrotowy głowy do stanu ap na podjednostce 30s (rys. 1e). Ruch a-site ASL dokładnie z obrotem głowy spowodowałby poważne zderzenie z domeną IV EF-G, ponieważ jest ona umieszczona w naszym kompleksie, co wraz z kontaktem utworzonym między wierzchołkiem domeny IV A helisą kodon-anticodon ap / ap tRNA (Fig. S16) sugeruje, że ruch mRNA i ASL są sprzężone z ruchem domeny IV.dodatkowe przemieszczenie ap/ap ASL zbliża go do PE/E ASL (Fig. 2C, D) (11). Pozycja głowy może być stabilizowana przez interakcję między fosforanem 1210 z 16S rRNA z domeną IV EF-G w Gly531.

najbardziej uderzające jest przegrupowanie pętli 16S rRNA 966 w głowie 30s, która odrywa się od miejsca P, aby dotrzeć do miejsca a, gdzie inicjuje kontakt z częściowo translokowanym ap / ap-ASL (rys. 2E, F). Ta przegrupowanie polega na zakłóceniu pakowania m22g966 w stosunku do rybozy 34 w miejscu P ASL (18, 19) i utworzeniu dopasowanej do powierzchni kieszeni wokół ap/ap-ASL przez nukleotydy a965, m22g966 i C1400. W strukturze krystalicznej odpowiedniego kompleksu jedno-tRNA (10) (rys. S6), stwierdzono, że pe/E tRNA ASL utrzymuje wszystkie kanoniczne kontakty P z głowicą 30s, w tym pętlę 966, ponieważ obraca się w kierunku miejsca E. Jednakże w opisanym tutaj kompleksie dwu-tRNA utrzymywany jest tylko podzbiór oddziaływań głowy w miejscu P 30s z PE / E ASL, obejmujący G1338, A1339, A1340 i C-końcowy ogon białka uS9. Tworzenie interakcji po translokacji jednocześnie z zakłóceniem interakcji przed translokacją sugeruje mechanizm przekazywania ASL między miejscami a i P. Może to również oznaczać początkowe przesunięcie styków, które musi zostać przerwane w celu uwolnienia pe / E tRNA ASL przed rotacją wsteczną głowy 30S w końcowych etapach translokacji (20, 21).

sieć oddziaływań powstała między zachowaną pętlą 1 (reszt 499-504) w domenie IV EF-G, AP / ap ASL i jego kodonem mRNA (Fig. S15) (11) są podobne do obserwowanych w stanie po translokacji (15), co sugeruje, że są utrzymywane przez cały cykl translokacji. Ich podobieństwo do interakcji między a1492 i A1493 z helisą kodon-anticodon w miejscu dekodowania (22) sugeruje, że mogą one pomóc w utrzymaniu prawidłowego parowania kodon-anticodon podczas ruchu między miejscami A I P (15) i są zgodne z propozycją, że EF-G ułatwia translokację poprzez destabilizację interakcji w miejscu dekodowania 30S (23).

interakcje między mRNA i elementami głowy 30S w dolnym tunelu wejściowym mRNA zostały zaproponowane w celu przenoszenia mRNA do przodu z tRNA podczas obrotu głowy (17). Nie jest jednak jasne, czy ruch sieciowy mRNA może być utrzymywany w ten sposób, ponieważ interakcje te są zakłócane podczas rotacji głowy. Odkrywamy, że wydłużony ogon mRNA, gdy wyłania się z dolnego tunelu, zakrzywia się w górę, aby związać się z powierzchnią białka uS3 w głowie podjednostki (rys. 3, S17). W ten sposób obrót głowy do przodu aktywnie poruszałby mRNA w kierunku translokacji. Porównanie położenia nukleotydu referencyjnego na mRNA w Stanach obróconych i nieobróconych dodatkowo pokazuje, że obrót głowy do przodu przyspieszyłby mRNA o jeden kodon (Fig. 3D), wspierające możliwość, że mRNA jest aktywnie poruszany przez rybosom podczas translokacji. Ponieważ wymiary dolnego tunelu wykluczają wejście helisy RNA, zaburzenie struktury drugorzędowej mRNA przez helikazę rybosomalną (24) musi nastąpić w miejscu lub w pobliżu wejścia do tunelu, poprzez interakcję z rybosomem poza tunelem. Wiązanie ogona mRNA natychmiast flankującego wejście do tunelu wyłącznie do głowy 30S zapewnia taką interakcję. Siły wytworzone przez obrót głowicy mogą w ten sposób destabilizować parowanie bazy w elementach spiralnych mRNA, gdy wchodzą one do dolnego tunelu.

w stanie klasycznym C74 i C75 w ogonie CCA Trna miejsca P tworzą pary zasad z G2252 i g2251, odpowiednio, w pętli P (H80) 23s rRNA, podczas gdy C75 Trna miejsca a pary z g2553 w pętli a (H92) (18, 25, 26). Interakcje te pozycjonują ugrupowania peptydylowe i aminoacylowe w reakcji peptydylotransferazy (27), która pozostawia deacylowany tRNA w miejscu P i peptydyl tRNA w miejscu A. Krytycznym etapem translokacji jest zatem późniejszy ruch końca peptydylo-CCA z pętli a do pętli P. Struktura półproduktu translokacyjnego ujawnia stan chimeryczny, odmienny od wcześniej opisanych (rys. S18), w którym koniec akceptora peptydylo-tRNA oddziałuje jednocześnie z obiema pętlami a I P (Fig. W tym stanie zachowuje się parowanie bazowe C75 z g2553 pętli a, podczas gdy ruch jej trzonu akceptora w położenie zbliżone do położenia klasycznego tRNA w miejscu P pozwala G2252 i G2253 w przearanżowanej pętli P zetknąć się ze szkieletem tRNA w pozycjach 72 i 70 (Fig . 4B). Tak więc koniec trzonu akceptora ap/ap-tRNA jest zakotwiczony na pętli P, ułatwiając przenoszenie sąsiednich resztek C74 i C75 z pętli a do pętli P. A76 tRNA AP / ap jest zorientowany podobnie do obserwowanego dla Trna związanego w stanie klasycznym P/P (17), z ugrupowaniem peptydylowym N-acetylo-walinowym umieszczonym na wejściu do tunelu wyjściowego peptydu, podczas gdy C74 i C75 utrzymują swoje interakcje z pętlą a 23s rRNA (Fig. 4, S19).

koniec akceptora ap/ap tRNA jednocześnie styka się z pętlami a I P 23s rRNA

podczas translokacji 3′ koniec akceptora peptydylo-tRNA przechodzi od (A) klasycznego stanu A/A do (B) pośredniego stanu ap/ap do (C) klasycznego stanu P/p, ułatwionego przez zmiany konformacyjne w pętlach a i P.

ap/ap-tRNA może odpowiadać stanom pośrednim charakteryzującym się kinetycznie. W badaniach kinetycznych metodą gaszenia fluorescencji stwierdzono związek pośredni zależny od EF-G (INT), w którym łokieć peptydylo-tRNA przemieszcza się z miejsca a w kierunku miejsca P, ale pozostaje tylko częściowo reaktywny z puromycyną naśladującą aminoacylo-tRNA, co sugeruje, że jego koniec CCA nie jest w pełni osadzony w miejscu P (28). Badania kinetyczne, w których sonda została przyłączona bezpośrednio do końca CCA peptydylo-tRNA, wykazały zależne od EF-G półprodukty translokacyjne, w których koniec akceptora peptydylo-tRNA porusza się w kierunku miejsca P, ale pozostaje niereaktywny puromycyna (29). Właściwości tych półproduktów są zgodne z obserwowanym tu stanem AP/ap. Struktura tego uwięzionego półproduktu translokacyjnego zaczyna opisywać, w jaki sposób tRNA porusza się między miejscami rybosomalnymi a i P. Same miejsca wiązania tRNA są dynamiczne, tworząc jednoczesne kontakty między A-tRNA i elementami zarówno miejsc A, jak i P, przypominając podanie pałki w biegu sztafetowym (30). Jest to widoczne zarówno dla podjednostek 30S i 50s. W podjednostce 30S, rearanżacja pętli 966 16S rRNA uwalnia G966 ze strony P ASL, aby skontaktować się ze stroną a ASL, gdy porusza się do strony 30S P (rys. 2E, F). W podjednostce 50S, pętle a I P 23s rRNA zmieniają układ, aby umożliwić obu pętlom kontakt z 3 ’ – akceptorowym końcem Trna w miejscu a, gdy zaczyna się jego przejście do miejsca 50s P (Fig. 4). Wyniki te pokazują, że dynamika strukturalna rybosomalnego RNA odgrywa aktywną rolę w mechanizmie translokacji.