Twój doradca mówi ci, że chce, abyś użył HPLC do analizy Twojego związku. Wiesz, że słyszałeś już o tej technice, ale nie pamiętasz, co oznacza skrót HPLC, nie mówiąc już o tym, jak to zrobić! Wszyscy tam byliśmy i założę się, że żałujesz, że nie poświęciłeś więcej uwagi na tym wykładzie!
nie bój się – w tej serii artykułów przypomnę ci o sile kolumny HPLC 🙂
w tym pierwszym artykule zapoznam cię z zasadą stojącą za HPLC i przypomnę o jej zastosowaniach-w mgnieniu oka będziesz gotowy do laboratorium!
jak działa HPLC?
wysokosprawna chromatografia cieczowa lub HPLC to długa nazwa potężnej techniki opartej na prostym fakcie, że poszczególne związki zachowują się inaczej w wodzie.
HPLC oddziela i oczyszcza związki zgodnie z ich polaryzacją lub skłonnością do lubienia lub niechęci do wody. Aby umieścić polaryzację w kontekście, weź pod uwagę, że olej jest cieczą apolarną, która nie miesza się z wodą. Etanol, z drugiej strony, jest polarny i jak wielu z was wie, bardzo dobrze miesza się z wodą (wódka i cola ktoś??).
próbowałem uprościć cały proces na rysunku 1 poniżej, ale najpierw spójrzmy na główne składniki zaangażowane w HPLC. Z góry przepraszam za jakiś nieunikniony żargon!
komponenty
kolumna HPLC
jest to również znane jako faza stacjonarna. Jest to koń pociągowy maszyny HPLC, wykonany jest z jednej z różnych substancji (często krzemionki) i ma bardzo zwarty charakter. Cząstki krzemionki są funkcjonalizowane przez długie łańcuchy węglowe. Łańcuchy węglowe są niepolarne, a zatem im dłuższy łańcuch, tym bardziej niepolarna staje się kolumna. Kolumny zawierające 18-węglowe łańcuchy są powszechnie stosowane i są znane jako kolumny C18.
próbki HPLC
różnią się znacznie w zależności od dziedziny i rodzaju omawianych związków. HPLC może być stosowany do analizy związków w próbkach biologicznych (mocz, krew, ślina i mięśnie), próbkach środowiskowych, Chemii Medycznej (leki) i Mikrobiologii (toksyny wytwarzane przez grzyby i bakterie).
wstrzyknięcie próbki
próbki są wstrzykiwane do kolumny HPLC. Kiedyś przeprowadzano to ręcznie, co oznaczało, że jakaś biedna dusza musiała godzinami siedzieć przy maszynie do HPLC, wstrzykiwając każdą próbkę strzykawką, czasami przez całą noc!
na szczęście nowsze modele mają automatyczny wtryskiwacz, zmniejszając ręczne wprowadzanie i umożliwiając większą przepustowość. Nowoczesne maszyny są wyposażone w oprogramowanie umożliwiające użytkownikowi wprowadzenie listy próbek, ile i w jakiej kolejności należy je wstrzyknąć. Więc możesz cieszyć się lunchem, gdy twój HPLC działa sam!
Faza ruchoma
to tak naprawdę tylko mieszanina wody i rozpuszczalnika organicznego (Zwykle acetonitrylu lub metanolu). Faza ruchoma otrzymuje swoją nazwę, ponieważ przemieszcza się przez kolumnę i jednocześnie eluuje (lub wypłukuje) związki z kolumny.
związki są często eluowane wzdłuż gradientu stężenia. Jeśli jesteś podobny do mnie, koncentracja i gradient to dwa słowa, których nie chcesz widzieć w zdaniu! Oznacza to po prostu, że procent wody w fazie ruchomej maleje z czasem, podczas gdy procent rozpuszczalnika apolarnego wzrasta jednocześnie. Oznacza to, że faza ruchoma stopniowo staje się bardziej apolarna. Na razie nie martw się zbytnio gradientami, ponieważ pojawią się one ponownie w kolejnym artykule.
uruchamianie HPLC
HPLC może być wykonywane w kilku trybach. Najczęściej stosowaną metodą jest tzw. faza odwrócona (RP-HPLC) i to właśnie opisuję tutaj. W tym trybie związki są rozdzielane, zaczynając od najbardziej polarnych, a kończąc na związkach apolarnych. We wszystkich trybach pompa o dużej mocy przesuwa próbkę i fazę ruchomą przez kolumnę. Typowy bieg może trwać od 10 do 60 minut.
zasada stojąca za HPLC – bliższe przyjrzenie się
teraz, gdy masz pomysł na komponenty, przejdźmy do zasady nieco bardziej szczegółowo.
wspomniałem powyżej, że HPLC oddziela związki na podstawie polaryzacji. Ale jak to właściwie działa? Angielski proszę! Wraz ze wzrostem gradientu stężenie rozpuszczalnika wzrasta, podczas gdy stężenie wody maleje. To sprawia, że faza ruchoma staje się coraz bardziej apolarna. Związki zawarte w próbce przyklejają się do łańcuchów węglowych w kolumnie, przy czym najbardziej apolarne związki przyklejają się najsilniej, a najbardziej polarne związki przyklejają się słabo.
Rysunek 1 pokazuje, co dzieje się z próbką zawierającą mieszaninę związków po wstrzyknięciu do kolumny. Związki wiążą się z kolumną i są wypłukiwane w różnym czasie, w zależności od tego, czy są bardziej skłonne do przyklejania się do kolumny, czy fazy mobilnej, gdy jest ona pompowana. Czas, w którym każdy związek wymywa (lub wypłukuje) z kolumny, jest znany jako czas retencji tego związku (Rf).
Rysunek 1: Zasada stojąca za HPLC
Rysunek 1: związki o różnej biegunowości (oznaczone jako ciemniejsze odcienie niebieskiego) są wstrzykiwane do kolumny HPLC (cały cylinder). Faza ruchoma jest pompowana przez kolumnę, a dodanie rozpuszczalnika wzdłuż gradientu stężenia (pokazanego jako czarna kropkowana linia) w sposób ciągły zmniejsza ogólną polaryzację fazy ruchliwej (oś Y). Związki są w stanie przyklejać się do kolumny lub fazy ruchomej, w zależności od tego, jak polarne są. Związki ostatecznie przykleją się do fazy mobilnej, gdy ich polaryzacja odpowiada polaryzacji fazy mobilnej. Będą one następnie oddzielać się od kolumny i będą eluowane w określonym czasie (oś X) podczas biegu. Ten czas jest znany jako Rf dla tego związku.
zrozumienie wyniku
wynik lub wyniki przebiegu HPLC są zwykle postrzegane jako chromatogram (Rysunek 2). Jest to pozioma seria pików reprezentujących związki eluowane z kolumny o różnych wartościach Rf. Nowoczesny sprzęt HPLC jest często sprzężony z detektorem diodowym (DAD), pozwalając użytkownikowi spojrzeć na otrzymany chromatogram rozdzielonych związków w długościach fal od 190 nm do 900 nm. Jeśli badane związki są znane, użytkownik może wybrać, aby spojrzeć tylko na 1 lub kilka wybranych długości fal. Na przykład kokainę można zaobserwować przy 254 nm.
ryc. 2: typowy chromatogram HPLC
ryc. 2: Ten chromatogram przedstawia separację związków z reakcji chemicznej, a chromatogram jest oglądany przy 254 nm. Dwa główne piki występują w 8,20 i 9 minut, reprezentując dwa związki o tych czasach retencji. Liczba jednostek absorbancji (AU)jest pokazana na osi Y, podczas gdy czas biegu jest pokazany na osi X.
zastosowania
w biologii i medycynie HPLC jest często używany jako narzędzie analityczne do oznaczania próbek biologicznych i środowiskowych na obecność lub brak znanych związków (na przykład metabolitów, leków, toksyn, pestycydów) i może pomóc w identyfikacji nieznanych związków.
w chemii jednak HPLC jest rutynowo stosowany do monitorowania reakcji chemicznych, a także do określania czystości produktów. Ponadto sposób HPLC można modyfikować do preparatywnego HPLC, przy czym związki będące przedmiotem zainteresowania mogą być oczyszczane do dalszego zastosowania.
HPLC może wydawać się bardzo skomplikowane na początku, ale bądź pewny, tak jak większość innych technik laboratoryjnych, ma to o wiele więcej sensu, gdy faktycznie to robisz.
wypatrujcie moich kolejnych artykułów w nadchodzących tygodniach, w których omówię kilka wskazówek na temat tego, w jaki sposób można uzyskać najlepsze wyniki z przebiegu HPLC w zależności od celu badawczego, a także omówię obiektywnie, w jaki sposób HPLC można wykorzystać w swoich badaniach.
czy są jakieś inne aspekty tej techniki, które chciałbyś omówić bardziej szczegółowo? Jeśli tak, chcielibyśmy usłyszeć od ciebie!
Happy HPLC-ing 🙂
czy to ci pomogło? Następnie podziel się z siecią.