Robert De Niro Sr. urodził się w Syracuse w stanie Nowy Jork w rodzinie irlandzko-amerykańskiej, Helen M. (z domu O ’ Reilly; 1899-1999). Matką Helen była Mary E. Burns (Urodzona przez Johna i Mary Burns), a ojcem Dennis Francis O 'Reilly, urodzony jako Ellen Hall z Dundrum, druga żona Edwarda O’ Reilly. Wcześniej było zamieszanie co do macierzyństwa Dennisa, jego matka wcześniej uważała się za drugą żonę Edwarda, Margaret.
włosko-amerykański ojciec Roberta, Henry Martin De Niro (1897-1976), urodził się w rodzinie, która wyemigrowała z Ferrazzano w 1887 roku, Angeliny Mercurio i Giovanniego Di Niro.
Robert był najstarszym z trójki dzieci; on i rodzeństwo John i Joan wychowywali się w Syracuse w stanie Nowy Jork. De Niro studiował w słynnym Black Mountain College pod kierunkiem Josefa Albersa w latach 1939-1940. Podczas gdy wysoce analityczne podejście Albersa do malarstwa nie odwoływało się do bardziej instynktownego stylu De Niro, doświadczenie i międzynarodowa perspektywa mistrza Bauhausu pozostawiły jednak trwałe wrażenie. De Niro uczył się u Hansa Hofmanna w letniej szkole w Provincetown w Massachusetts. Nauczanie Hofmanna o Ekspresjonizmie abstrakcyjnym i Formalizmie kubistycznym miało duży wpływ na rozwój De Niro jako dojrzałego artysty.
W Szkole Letniej Hofmanna poznał koleżankę Virginię Admiral, którą poślubił w 1942 roku. Para przeniosła się do dużego, przewiewnego loftu w nowojorskiej Greenwich Village, gdzie mogli malować. Otoczyli się znakomitym kręgiem przyjaciół, w tym pisarzami Anaïs Nin i Henry Miller, dramaturgiem Tennessee Williamsem oraz aktorką i słynną Berlińską tancerką Valeską Gert. Admirał i De Niro rozstali się krótko po tym, jak ich syn Robert De Niro Jr.urodził się w sierpniu 1943 roku po tym, jak De Niro ujawnił się jako gej. W 1944 De Niro związał się z poetą Robertem Duncanem.
po studiach u Hansa Hofmanna w Nowym Jorku i Provincetown oraz Josefa Albersa w Black Mountain College w Karolinie Północnej pod koniec lat 30.i na początku lat 40. De Niro pracował przez pięć lat w legendarnym Muzeum Sztuki Nieobiektywnej Hilli Rebay. W 1945 roku brał udział w wystawie zbiorowej Peggy Guggenheim ’ s Art of This Century w Nowym Jorku, która była wiodącą galerią sztuki zarówno uznanych europejskich modernistów, jak i członków wyłaniającej się abstrakcyjnej grupy ekspresjonistycznej, takiej jak Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell i Clyfford Still. De Niro miał swoją pierwszą indywidualną wystawę w galerii Guggenheima w kwietniu i maju następnego roku. Tworzył wówczas przede wszystkim w sposób abstrakcyjny, często z odniesieniami figuralnymi. Większość jego prac z tego okresu zaginęła w pożarze studia w 1949 roku.
De Niro miał serię wystaw indywidualnych w latach 50.W Charles Egan Gallery w Nowym Jorku, gdzie wystawiał prace Willema de Kooninga i innych wczesnych abstrakcyjnych artystów ekspresjonistycznych. Krytycy chwalili kompozycje DeNiro wypełnione improwizowanymi obszarami o żywych kolorach, które ustąpiły miejsca luźno namalowanym martwym charakterom i krzywiznom aktów. W połowie lat 50. De Niro regularnie uczestniczył w ważnych wystawach zbiorowych, takich jak Whitney Annual, The Stable Annual i Muzeum Żydowskie. W 1958 otrzymał Nagrodę Fundacji Longview.
w latach 1961-1964 De Niro podróżował do Francji, aby malować w Paryżu i na okolicznych wsiach. Kolekcjoner Joseph Hirshhorn zakupił szereg obrazów i prac na papierze w tym okresie za pośrednictwem galerii De Niro, Virginii Zabriskie, które obecnie znajdują się w stałej kolekcji Hirshhorn Museum and Sculpture Garden W Waszyngtonie. W 1968 otrzymał Stypendium Guggenheima.