Wpływ cholesterolu na strukturę dwuwarstwy fosfolipidowej

słowa kluczowe:

• biomembrana
• symulacja molekularna
• zachowanie fazowe
• dimyristoylphosphatidylocholine
• model mezoskopowy

w tym artykule poruszamy pozornie proste pytanie termodynamiczne: jak zmienia się obszar na cząsteczkę błony fosfolipidowej, jeśli dodamy cholesterol? To pytanie zostało po raz pierwszy postawione przez Leathesa (1) w 1925 roku i jest nadal omawiane dzisiaj. Znaczenie tego pytania odnosi się bezpośrednio do znaczenia cholesterolu dla funkcjonowania błon wyższych eukariotów. Na przykład cholesterol reguluje płynność błony i moduluje funkcję białek błonowych (2). Zrozumienie tych mechanizmów zmotywowało wielu badaczy do szczegółowego zbadania interakcji lipid-cholesterol. Ponieważ membrana może być postrzegana jako ciecz 2D, pierwszym oszacowaniem, w jaki sposób powierzchnia na cząsteczkę zmieniłaby się po dodaniu cholesterolu, byłoby założenie idealnego mieszania, gdzie powierzchnia na cząsteczkę jest po prostu średnią ważoną obszarów czystych składników. W 1925 roku Leathes wykazał, że zamiast idealnego mieszania obserwuje się uderzające zachowanie nieidealne (1). To nieidealne zachowanie nazywa się efektem kondensacji (3), ponieważ obszar na cząsteczkę jest znacznie niższy w porównaniu z idealnym mieszaniem. Ponieważ membrana zachowuje się jak niezciśnięty płyn, zmniejszenie powierzchni na cząsteczkę spowoduje odpowiedni znaczący wzrost całkowitej grubości dwuwarstwy. Taki wzrost grubości sygnalizuje reorganizację struktury membrany. Ponieważ zmiany w strukturze błony mogą mieć istotne konsekwencje dla funkcjonowania białek (2), ważne jest lepsze zrozumienie molekularne zmian wywołanych cholesterolem.

zaproponowano różne modele koncepcyjne, aby wyjaśnić nieidealne interakcje cholesterol–lipid. Przykłady obejmują model skondensowanych kompleksów (4, 5), Model superlattice (6) i model parasolowy (7). Model skondensowanych kompleksów wyjaśnia efekt kondensacji, zakładając, że cholesterol indukuje odwracalne tworzenie stechiometrycznego kompleksu cholesterolowo–lipidowego. W takim kompleksie błona jest skondensowana, ponieważ łańcuchy acylowe lipidów są bardziej uporządkowane. Przy danym stężeniu cholesterolu istnieje kompozycja równowagi między tymi skondensowanymi kompleksami cholesterolowo-lipidowymi a zwykłymi lipidami. Model superlattice zakłada, że w krytycznych stężeniach cząsteczki cholesterolu wykazują specyficzny, dalekosiężny porządek. Model parasolowy przyjmuje punkt widzenia, że hydrofilowa część cholesterolu jest zbyt mała i dlatego lipidy muszą przyczyniać się do przesiewania cząsteczek cholesterolu z hydrofobowych interakcji z wodą. Fosfolipidy mogą stworzyć ten parasol tylko wtedy, gdy te cząsteczki wyprostują się, aby zrobić miejsce dla cholesterolu. W modelach tych podstawowe mechanizmy prowadzące do kondensacji są bardzo różne. Co ciekawe, niedawne badania eksperymentalne wykazały, że ich dane wspierały model skondensowanych kompleksów (8), podczas gdy inny zestaw eksperymentów nie znalazł żadnych wskazań skondensowanych kompleksów i wspierał model parasolowy (9). Te różnice w spostrzeżeniach zmotywowały nas do opracowania mezoskopowego modelu układu lipid–cholesterol–woda. Użyliśmy symulacji molekularnych, aby rzucić trochę światła na boczną organizację cholesterolu w błonach lipidowych i leżące u ich podstaw interakcje lipid-cholesterol, które wywołują efekt kondensacji.

w literaturze opisano kilka symulacji molekularnych all-atom i gruboziarnistych modeli cholesterolu w dwuwarstwach lipidowych (kilka ostatnich przykładów, patrz refs. 10-13 i odniesienia do nich). Najlepiej byłoby użyć symulacji all-atom do badania efektu kondensacji w szerokim zakresie temperatur i kompozycji. Obecnie jednak symulacje te są zbyt czasochłonne. Dlatego używamy modelu gruboziarnistego, w którym wydajność uzyskuje się poprzez zintegrowanie niektórych szczegółów modelu all-atom. Nasz model oparty jest na modelu Kranenburga i współpracowników (14, 15). Model wykorzystuje wyraźne cząsteczki wody. Lipidy i cholesterol składają się z cząsteczek hydrofilowych i hydrofobowych (patrz ryc. 1). Model ten grudkuje grupy atomów w jeden mezoskopowy pseudoatom. Wewnątrzcząsteczkowe interakcje obejmują drgania wiązania i zginanie wiązania, których parametry zostały zoptymalizowane tak, aby naśladować strukturę pojedynczej cząsteczki fosfatydylocholiny w wodzie. Interakcje hydrofilowe i hydrofobowe opisano za pomocą oddziaływań miękko-odpychających, a parametry tych oddziaływań są związane z parametrami rozpuszczalności przy użyciu metody opisanej przez Groota i Rabone ’ a (16). Ideą tego modelu jest to, że głównymi siłami napędowymi mieszania cholesterolu z fosfolipidem są interakcje hydrofobowe i hydrofilowe, co jest wynikiem wielu badań eksperymentalnych (7, 9, 17). W naszym modelu jednostka długości jest bezpośrednio związana z efektywną wielkością pseudoatomu, tzn. jeden pseudoatom zajmuje objętość 90 Å3. Jednostka energii wynika z dopasowania parametrów miękkości mezoskopowych cząstek wody do ściśliwości wody w warunkach otoczenia. Prostota modeli wymaga reparametryzacji tych miękkich odpychaczy, jeśli temperatura zostanie zmieniona. Jednak w tej pracy Zakładamy, że parametry są niezależne od temperatury. Skala temperatury jest ustawiana przez dopasowanie do temperatury przejścia fazy eksperymentalnej. Więcej szczegółów i zastosowań tego modelu można znaleźć w ref. 18.

Nasz model cholesterolu, pokazany na Rys. 1B, opiera się na tych samych założeniach dotyczących efektywnej wielkości i oddziaływań, co model lipidowy. Po McMullen et al. (19), zrobiliśmy hydrofobową część modelu cholesterolu nieco dłuższą niż hydrofobową część modelu lipidowego, która ma reprezentować dimyristoylphosphatidylocholine (DMPC). Dla uproszczenia założyliśmy, że hydrofobowe i hydrofilowe interakcje cząsteczki cholesterolu są podobne do tych w lipidach. Aby uzyskać wgląd w molekularny mechanizm kondensacyjnego działania cholesterolu, wprowadziliśmy trzy cząsteczki podobne do cholesterolu, w których zaburzamy równowagę hydrofobowo–hydrofilową cząsteczki: jedną, w której zmniejszamy hydrofobową Długość ogona (patrz Rys. 1C), w którym dodajemy dodatkową grupę hydrofobową (rys. 1D) i taki, w którym zastępujemy pierścień prostym łańcuchem (rys. 1e).

rys. 2 przedstawia obliczony schemat fazy składu temperatury układu woda-fosfolipid-cholesterol. Granice fazowe uzyskano z oględzin migawek i, bardziej ilościowo, z punktów przegięcia krzywych, które dają powierzchnię na lipid, średnią grubość hydrofobową błony oraz parametry kolejności ogona i nachylenia. Właściwości te obliczano jako funkcję temperatury i zawartości cholesterolu.

najpierw skupmy się na fazach czysto lipidowych, a wpływ cholesterolu zostanie omówiony w następnej kolejności. Dla dwuwarstwy czystego lipidu diagram fazowy został obliczony przez Kranenburga i Smita (14) dla układu, który jest czterokrotnie mniejszy. Użyliśmy tej samej metodologii, aby zlokalizować granice fazowe, co Kranenburg i Smit (14). Nasze wyniki są w doskonałej zgodzie z tym badaniem, co wskazuje, że efekty skończonej wielkości są małe. Dla czystego fosfolipidu obserwujemy w wysokich temperaturach fazę ciekłą (La), w której ogony są nieuporządkowane. W niskich temperaturach ogony są uporządkowane i przechylone, co określa fazę żelu (L ’ C). Te dwie fazy są oddzielone fazą falowaną (P’β), w której obserwujemy mikrofazową separację domen, w których dwuwarstwowa jest gruba, a lipidy uporządkowane, a domeny, w których dwuwarstwowa jest cienka, a lipidy nieuporządkowane. Obecność tych trzech faz wskazuje, że powstały diagram fazowy jest w bardzo dobrej zgodzie z diagramem doświadczalnym czystego lipidu (20). Skala temperatury jest ustalana przez dopasowanie temperatur przejść fazowych fazy żelowej do fazy tętnienia (TP) i fazy tętnienia do fazy ciekłej (Tm) z odpowiednimi temperaturami przejścia fazy Doświadczalnej czystego DMPC. Dalsze porównanie z danymi eksperymentalnymi jest wykonane dla średniej powierzchni na cząsteczkę dwuwarstwy (Fig. 3A), dla grubości dwuwarstwowej (rys. 4A), a dla porządku ogona lipidowego (rys. 4B). Dla powierzchni na lipid otrzymujemy 56 Å2 na cząsteczkę w porównaniu z eksperymentalnym (21) 60 Å2 na cząsteczkę. Dla grubości dwuwarstwy obliczyliśmy wartość 38,7 Å, Co dobrze porównuje się z wartością eksperymentalną 36 Å (21), a podobne porozumienie uzyskuje się dla porządku ogona (patrz Rys. 4B). Aby obliczyć powierzchnię na cząsteczkę czystego cholesterolu, symulowaliśmy dwuwarstwę czystego cholesterolu. Uzyskaliśmy wartość 40,3 Å, co bardzo dobrze porównuje się z najnowszą wartością doświadczalną 41 Å (22) dla monowarstwy cholesterolu. Biorąc pod uwagę przybliżenia dokonane w naszym modelu, porozumienie między wartościami eksperymentalnymi i symulowanymi jest zaskakująco dobre.

przejdźmy teraz do wpływu cholesterolu na właściwości dwuwarstwy. Pierwszym pytaniem, które zajmiemy się, jest to, czy nasz model może odtworzyć efekt kondensacji. Fig. 3A pokazuje wpływ cholesterolu na obszar na cząsteczkę w funkcji stężenia cholesterolu. Porównanie z danymi eksperymentalnymi po raz kolejny pokazuje bardzo dobre porozumienie. Na tym rysunku pokazujemy również obszar na cząsteczkę przy założeniu idealnego mieszania. Ta liczba w przekonujący sposób ilustruje efekt kondensacji; powierzchnia na cząsteczkę zmniejsza się o wiele więcej, niż można by się spodziewać na podstawie idealnego mieszania. Inne dane doświadczalne obejmują wpływ cholesterolu na obrzęk dwuwarstwowy (rys. 4A) i parametr kolejności ogona (rys. 4B). Zarówno dane eksperymentalne, jak i symulacja pokazują, że cholesterol zwiększa grubość dwuwarstwy i jej kolejność. Również dla tych dwóch właściwości, nasze wyniki symulacji są w bardzo dobrej zgodzie z danymi eksperymentalnymi. Dane symulacyjne i eksperymentalne (Fig. 3A i 4 A i B) wykazują, że dodanie cholesterolu silnie modyfikuje właściwości dwuwarstwy lipidowej do ±30 mol% cholesterolu. Następnie osiąga się region, w którym dalsze dodawanie cholesterolu ma tylko niewielki wpływ. Przy 30 mol% cholesterolu, zarówno powierzchnia na cząsteczkę, jak i kolejność lipidów i parametry nachylenia mają wartości typowe dla fazy żelowej.

kodowanie kolorami na Rys. 2 pokazuje różnicę między symulowanym obszarem na lipid a wartością oszacowaną przez założenie idealnego mieszania. Obserwujemy, że w wysokich i niskich temperaturach efekt kondensacji jest stosunkowo niewielki. Efekt kondensacji jest maksymalny w dobrze określonym obszarze w przestrzeni fazowej, który znajduje się tuż nad przejściem fazy głównej czystego fosfolipidu. Aby lepiej zrozumieć naturę efektu kondensacji, ważne jest, aby zrozumieć wpływ dodawania cholesterolu na zachowanie fazowe błony.

rys. 2 pokazuje najważniejsze cechy diagramu fazowego. Różne fazy, które obserwowaliśmy w naszych symulacjach, były również obserwowane doświadczalnie, chociaż nie zawsze dla specyficznej mieszaniny DMPC i cholesterolu (20, 23, 24). Jednak różne badania eksperymentalne wykazują jakościowo bardzo różne diagramy fazowe, co ogranicza nasze możliwości dokonania szczegółowego porównania. Migawki różnych faz można znaleźć na Rys. 5.

w bardzo wysokich temperaturach dodatek do 50 mol% cholesterolu ma niewielki wpływ na strukturę błony i obserwujemy fazę La dla wszystkich stężeń (24). W temperaturach poniżej Tp obserwujemy, że cholesterol zmienia strukturę fazy żelowej poprzez hamowanie pochylenia ogonów lipidowych, powodując powstanie fazy L ’ C(20) (porównaj rys. 5 D z E). Przy wyższych stężeniach cholesterolu (>20%) obserwujemy powstawanie małych, bogatych w cholesterol skupisk. Tę fazę oznaczamy LII, a tę fazę pokazano na Fig. 5e. w temperaturach między Tp i Tm czysta dwuwarstwowa jest w fazie tętnienia, a cholesterol przekształca tę fazę tętnienia(patrz Rys. 5C) w fazę uporządkowaną cieczą (23) (rys. 5b). Termin Faza uporządkowana cieczą został wprowadzony przez Ipsena i wsp. (25). Grubość dwuwarstwy jest pośrednią między grubością cieczy a fazą żelową. Parametry rzędu lipidów mają wartości zbliżone do fazy żelowej, jednak w przeciwieństwie do fazy żelowej lipidy są bardziej nieuporządkowane i nie przechylają się. Cholesterol stopniowo zwiększa temperaturę, w której następuje przejście fazowe La Do Lo. Przy bardzo wysokich stężeniach cholesterolu, Faza uporządkowana cieczą przekształca się w fazę żelową (LII), gdy temperatura spada poniżej Tm. Faza ta była obserwowana doświadczalnie dla dipalmitoilofosfatydylocholiny (26), ale nie znaleźliśmy danych doświadczalnych dla DMPC w tych warunkach. Wróćmy teraz do efektu kondensacji. Fig. 2 pokazuje, że efekt kondensacji jest maksymalny w temperaturze tuż powyżej głównego przejścia TM. Powodem jest to, że w tych warunkach czysta dwuwarstwowa jest w stanie nieuporządkowanym cieczą, podczas gdy dodanie cholesterolu do dwuwarstwy przekształca go w fazę uporządkowaną cieczą, która ma obszar na lipid, który jest znacznie mniejszy w porównaniu ze stanem nieuporządkowanym cieczą. Ta duża różnica powoduje duży efekt kondensacji. W wyższych temperaturach faza ciekła pozostaje stabilna dla wszystkich stężeń cholesterolu, dając znacznie mniejszy efekt kondensacji. W niższych temperaturach, czysta dwuwarstwy lipidowej ma obszar na lipid, który jest znacznie bliżej obszaru na lipid fazy ciekłej uporządkowanej, w wyniku czego efekt kondensacji jest znacznie mniejszy.

powyższe wyniki wskazują, że efekt kondensacji jest bezpośrednią konsekwencją szczególnych zmian w zachowaniu fazowym, które wywołuje cholesterol. W literaturze istnieją różne spekulacje na temat tych aspektów struktury cholesterolu, które są szczególnie odpowiedzialne za jego działanie kondensacyjne. Na przykład model parasolowy opiera się na założeniu, że w porównaniu z fosfolipidami, hydrofilowa część cholesterolu jest znacznie mniejsza i potrzebuje fosfolipidu, jako parasola, do dodatkowego badania przesiewowego z interakcji z wodą. Sugeruje to, że dodatkowa Grupa hydrofilowa całkowicie zmieniłaby właściwości. Innym ważnym czynnikiem jest nieporęczna struktura pierścienia; jeśli zastąpimy pierścień ogonem, otrzymamy cząsteczkę przypominającą bardziej cząsteczkę alkoholu (27). Jednak skrócenie hydrofobowego ogona miałoby niewielki wpływ. Fig. 1 pokazuje zmodyfikowane cząsteczki cholesterolu, które naśladują te zmiany. Rzeczywiście, wyniki na Rys. 3b pokazują, że skracanie ogona cholesterolu wykazuje ten sam efekt kondensacji. Jednak Rys. 3B pokazuje, że w przypadku obu innych modyfikacji cząsteczki cholesterolu, dodania dodatkowej grupy hydrofilowej i zastąpienia pierścienia łańcuchem liniowym, nie obserwuje się efektu kondensacji. Obserwujemy odwrotny efekt: dodanie tych cząsteczek powoduje, że dwuwarstwy stają się bardziej rozszerzone w porównaniu z idealnym mieszaniem. Wpływ (mniejszych) alkoholi na obszar na cząsteczkę został zmierzony doświadczalnie, a dane eksperymentalne również wykazują wzrost (28). Ściśle z tym związane, zaobserwowaliśmy, że dla obu przypadków na diagramie fazowym faza ciekła była stabilna w całym zakresie stężeń. W rzeczywistości obserwujemy, że dodanie tych cząsteczek zmniejsza główną temperaturę przejścia, a zatem nie ma obszaru na diagramie fazowym, w którym występuje duży efekt kondensacji.

symulacje z tymi strukturalnymi zmianami cholesterolu wskazują, jak zaskakująco subtelny jest ten mechanizm. Główne przejście w czystej dwuwarstwowej jest bardzo wrażliwe na oddziaływania hydrofobowe. Główki lipidów odsłaniają hydrofobowe ogony z wody. W wysokich temperaturach powierzchnia na lipid jest wysoka, a badanie to dalekie jest od optymalnego, ale w tych warunkach dominuje Entropia łańcucha. Obniżenie temperatury sprawia, że coraz większe znaczenie ma przesiewanie oddziaływań hydrofobowych, a przy głównym przejściu ostatecznie indukuje uporządkowanie łańcuchów. Kluczowym aspektem jest zrozumienie, w jaki sposób cholesterol destabilizuje fazę ciekłą. Cholesterol ma mniejszą głowicę hydrofilową i dlatego jest mniej skuteczny w osłanianiu interakcji hydrofobowych. W wysokich temperaturach dwuwarstwy lipidowe mogą to pomieścić, ale w niższych temperaturach lipidy mogą tylko przyczynić się do przesiewania cholesterolu, zmniejszając jego powierzchnię na lipid. Powoduje to obserwowaną kolejność i wyjaśnia, dlaczego zwiększa się główne przejście. Dwie zmiany, które wprowadziliśmy do struktury cholesterolu, wpływają na jego hydrofobowe badania przesiewowe; w obu wariantach zanika samoistne niedoczynność cholesterolu. Jeśli te cząsteczki są dodawane do dwuwarstwy, nie ma potrzeby dodatkowego przesiewania oddziaływań hydrofobowych, a cząsteczki te zapobiegają tworzeniu uporządkowanej fazy.

porównajmy nasze obserwacje z poprzednimi modelami, które zostały wprowadzone w celu wyjaśnienia efektu kondensacji. Po pierwsze, nasz model nie daje żadnych wskazówek dotyczących zamówień dalekiego zasięgu, jak zakłada się w modelu superlattice. Zarówno model parasolowy, jak i skondensowane kompleksy są założeniem jakiejś lokalnej organizacji. Na przykład w modelu parasolowym zakłada się, że jedna cząsteczka lipidu może przesiewać jedną lub dwie sąsiadujące cząsteczki cholesterolu (patrz np. 2). Nasze symulacje pokazują znacznie bardziej nieuporządkowaną strukturę, w której nie możemy zidentyfikować tych uporządkowanych struktur. W tym miejscu należy przypomnieć, że nasz model zawiera wiele założeń, a to rodzi pytanie, czy wnioski, które wyciągamy z naszych symulacji, są istotne dla Systemów eksperymentalnych. Byliśmy bardzo zaskoczeni, widząc, że byliśmy w stanie uzyskać tak bogate zachowanie fazowe za pomocą gruboziarnistego modelu, który wykorzystuje siły czysto odpychające. Nasz model daje bardzo rozsądny ilościowy opis najnowszych danych doświadczalnych na temat struktury dwuwarstwy. Innym interesującym aspektem jest to, że nasze obliczenia przewidują, że efekt kondensacji jest maksymalny w wąskim zakresie temperatur powyżej przejścia głównego. Możliwe jest zweryfikowanie tego eksperymentalnie. Bardzo rygorystycznym testem naszego modelu byłoby szczegółowe porównanie z diagramem fazy eksperymentalnej. W tym kontekście zachęcające jest to, że fazy, które znaleźliśmy, były obserwowane doświadczalnie, chociaż nie zawsze dokładnie dla symulowanego systemu. Starannie wybierając te dane eksperymentalne, które zgadzają się z naszymi symulacjami, możemy nawet pochwalić się bardzo dobrą zgodą. Możliwym powodem rozbieżności między różnymi eksperymentami jest to, że stosuje się różne techniki, a nie wszystkie techniki są równie wrażliwe na różnice w strukturze różnych faz. Mamy nadzieję, że połączenie diagramu fazowego i szczegółowych informacji na temat struktury różnych faz daje pewne wytyczne co do tego, czy dana technika eksperymentalna może zidentyfikować konkretną przemianę fazową.