wszystkie metody przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę.
Materiał
porównano następujące opatrunki srebrne: Acticoat (Smith & Nephew, Wielka Brytania; określane w tym artykule jako Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, Wielka Brytania; określane w tym artykule jako Aq), Silvercel Hydro-Alginate (Systagenix, Wielka Brytania; określone w niniejszym artykule jako Sc) oraz Ialugen Plus (ibi, Republika Czeska; określone w niniejszym artykule jako Ia).
inne chemikalia otrzymano z Sigma-Aldrich (St.Louis, USA), jeśli nie podano inaczej.
przygotowanie ekstraktów
w kilku testach stosowano ekstrakty z opatrunków, a nie same opatrunki. Ekstrakty te przygotowano z użyciem soli fizjologicznej (0,9% (w / v) NaCl) lub pożywek do hodowli komórkowych uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Stosunek powierzchni opatrunkowej do roztworu wynosił 1 cm2 na 4 mL roztworu. Ekstrakcję prowadzono przez 72 godziny w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Ekstrakty sterylizowano przez przepuszczenie ich przez filtr 0,2 µm i przechowywano w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
pomiar stężenia Srebra
stężenia srebra w opatrunkach i ekstraktach opatrunków mierzono za pomocą ICP-OES. Stężenie srebra oceniano również w próbkach skóry świń ex vivo. 10-70 mg każdej próbki przeniesiono do naczynia PTFE w celu trawienia mikrofalowego. Następnie 1 mL stężonego kwasu azotowego (trace analysis grade, Analytika Ltd., Czechy), 0.8 mL stężonego kwasu solnego (trace analysis grade, Analytika Ltd., Republika Czeska) i 0,2 mL nadtlenku wodoru (P. A. 30%, Penta Ltd., Czechy). Próbkę trawiono w temperaturze 150 °C przez 5 minut, a następnie, w drugim etapie tego samego cyklu, w temperaturze 200 °C przez 10 minut. Po trawieniu próbkę przeniesiono ilościowo przy użyciu 0,2 mL nadtlenku wodoru i dejonizowanej wody.
analizę wykonano przyrządem ICP-OES (Radial 725, Agilent Technologies, Australia) wyposażonym w pneumatyczny nebulizator Sea-spray i cyklonową komorę natryskową. Kwantyfikację oparto na zewnętrznej kalibracji. Dokładność i niezawodność metody zostały przetestowane przy użyciu próbek skóry świń ze znanymi stężeniami Ag z certyfikowanego roztworu referencyjnego (Analytika Ltd., Czechy).
skaningowa mikroskopia elektronowa
analizy skaningowej mikroskopii elektronowej (sem) przeprowadzono przy użyciu instrumentu Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Niemcy). Próbki zostały pokryte cienką warstwą Au/Pd w powlekarce rozpylającej quorum SC7620. Obrazy zostały wykonane przez dwa wtórne detektory elektronów InLens i SE2 odpowiednio dla większego lub niższego powiększenia. Parametry skanowania były następujące: napięcie przyspieszające, 3,5 kV; prąd sondy, 36 pA; i ciśnienie w komorze, ~ 7 × 10-5 Pa.
obrazy EDX zostały zarejestrowane przy pomocy instrumentu Zeiss Ultra Plus. Mapy rentgenowskie i widma zostały wykonane przez detektor rentgenowski X-MaxN 80 (Oxford Instruments, Wielka Brytania). Parametry EDX były następujące: napięcie przyspieszające, 10 kV; prąd sondy, 300 pA; odległość robocza, 8,5 mm; i czas procesu, 4 .
bezpośrednia aktywność oksydacyjna opatrunków
wytwarzanie ROS w Warunkach wolnych od komórek oceniano stosując 3,3′,5,5′-tetrametylo-benzydynę (TMB) jako substrat dla peroksydazy chrzanowej (HRP). Z opatrunków wycięto kółka o średnicy 6 mm i przebadano. Krótko mówiąc, roztwór roboczy składał się z 0,1 mg/mL TMB (roztwór podstawowy C = 1 mg/mL w DMSO) zmieszanego w stosunku 1:9 z 0,05 M buforem cytrynianowo–fosforanowym (pH = 5) i HRP (końcowe C = 0,16 J.M./mL). Każdy kawałek opatrunku zanurzono w 0,5 mL roztworu roboczego i próbki (25 µL) pobrano w czasie 0, 5, 7,5 i 10 min. Bezpośrednio po pobraniu próbki zmieszano w stosunku 1:1 z 0,16 M H2SO4, a absorbancję odczytano przy 450 nm (długość fali odniesienia = 540 nm) za pomocą instrumentu NanoDrop Onec (ThermoFisher Scientific, US). Jako pozytywną kontrolę zastosowano 30% H2O2. Sygnał tła (rozwiązanie puste) został odjęty.
przenikanie srebra do skóry pozbawionej nabłonka
do badania przenikania srebra do skóry pozbawionej nabłonka użyliśmy statycznych komórek dyfuzji. Skórę pozyskano z miejscowej rzeźni (Bocus, Letohrad, Czechy) i wycięto z wewnętrznej części małżowiny świńskiej. Włosy ogolono, skórę inkubowano w PBS (60 °C, 90 s), a naskórek został oderwany. Średnia grubość skóry pozbawionej nabłonka wynosiła 2 mm. kawałki skóry umieszczano w komorze i przykrywano testowanym srebrnym opatrunkiem lub kawałkiem gazy. Każda komora dawcy została wypełniona 0,3 mL pożywki hodowlanej NHDF z 10% FBS. Komora akceptora zawierała 0,7 mL pożywki hodowlanej. Komórki dyfuzyjne inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 lub 48 godzin. Po inkubacji skórę przepłukano PBS, A części skóry, które oddzielały komorę dawcy i akceptora, analizowano pod kątem zawartości srebra za pomocą ICP-OES, jak opisano powyżej. Ilość srebra, która przeniknęła przez pozbawioną nabłonka skórę, została zmierzona w płynie dawcy. W obu przypadkach przygotowano trzy niezależne replikaty.
Hodowla skóry ex vivo opatrunkami
świeże (1-2 h) małżowiny uszne (Bocus) skrupulatnie oczyszczono mydłem i betadyną (roztwór jodu PVP, Egis Pharma, Węgry) i spłukano wodą. Kawałki skóry (1 × 1 cm) z małżowiny usznej wycięto i umieszczono w roztworze antybiotyku (roztwór penicyliny–streptomycyny, 10 000 j./mL penicyliny, 10 mg/mL streptomycyny) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze O2 I CO2. Próbki skóry z nienaruszonym naskórkiem umieszczano od strony skórnej do góry w 6-studzienkowych płytkach uprawowych z 3 mL pożywki nhdf uzupełnionej 10% FBS, a następnie pokrywano 1 × 1 cm wyselekcjonowanego opatrunku zawierającego srebro lub sterylnej gazy kontrolnej nasączonej 300 µl pożywki uprawowej. Próbki inkubowano przez 24 lub 48 godzin. Następnie skórę przepłukano PBS i każdy z wybuchów skóry podzielono na trzecie do badania histologicznego (4% utrwalanie PFA w temperaturze 4 °C), analizy białek za pomocą Western blot (zamrażanie snap ciekłym azotem) i qPCR (przez noc w RNAlater (Thermo Fisher Scientific), a następnie w temperaturze − 80 °C).
barwienie histologiczne
autometalograficzne barwienie srebra zostało przyjęte zgodnie z Danscher et al.49. Zdjęcia zostały wykonane przy użyciu mikroskopu Eclipse 50i z dołączonym aparatem DS-Fi1 (Nikon, Yokohama-Shi, Japonia).
dla immunofluorescencji yH2AX, sekcje histologiczne na szkiełkach Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) były deparaffinizowane i inkubowane przez noc z pierwotnym przeciwciałem (1:1000, anty-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, USA). Następnie inkubowano je przez 1 godzinę z przeciwciałem wtórnym (ab150114, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania; rozcieńczenie 1:10 000) i montowano na szkiełkach z przedłużającym się diamentowym środkiem Przeciwfazowym z DAPI (ThermoFisher Scientific). Zdjęcia zostały wykonane mikroskopem fluorescencyjnym Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japonia).
ekspresja genu
Skóra świń po inkubacji opatrunkami została przetworzona do izolacji RNA, syntezy cDNA i ekspresji genu qPCR, jak opisano wcześniej przez Kleina i wsp.50 testów PCR w czasie rzeczywistym TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) używanych dla qPCR to: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; Hsph1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Wartości progowe cyklu znormalizowano dla genu utrzymującego rpl13a i dotyczyły próbek kontrolnych z gazy dla określonego czasu (interwał 24−lub 48-h) przy użyciu metody 2-Δδct51. Zmierzono i uśredniono sześć niezależnych próbek dla każdego zabiegu i czasu. Znaczenie różnic w ekspresji genów względem kontroli gazy oceniano za pomocą testu t Studenta dla każdego opatrunku srebrnego w określonym czasie.
Western blot
do późniejszej analizy Western blot, lizaty tkankowe przygotowano z zamrożonej skóry świń. Użycie skalpela w kropli buforu do lizy (50 mM tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% dezoksycholanu sodu; 1% siarczanu dodecylu sodu; 4% mocznika), skórę pocięto na małe kawałki, które następnie homogenizowano w 350 µl buforu do lizy przy użyciu 5 mm kulki ze stali nierdzewnej i homogenizatora tkankowego (Tissuelyser II, Qiagen, Hilden, Niemcy) przez 10 minut przy częstotliwości 25 Hz. Stężenie białka mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (Thermo Fisher Scientific).
białka w lizatach oddzielono za pomocą 4-15% gradientu SDS-PAGE i przeniesiono na membrany polifluorku winylidenu. W celu wykrycia specyficznych białek błony inkubowano przez noc w buforze blokującym (20 mm Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% suszonego niskotłuszczowego mleka w proszku) z pierwotnym przeciwciałem fosfo-histonem H2A.X (20E3) (1:1000; Cell Signaling, US). β-aktyna była używana jako kontrola ilości białka (1: 2000; Santa Cruz, USA). Membrany zostały opracowane z użyciem sprzężonego z HRP anty-królika lub anty-myszy Ig z wykorzystaniem detekcji chemiluminescencyjnej do wizualizacji sygnałów (Clarity Western ECl substrat; Bio-Rad, US). Sygnały zostały zeskanowane i ocenione za pomocą Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVITEC Limited, UK).
działanie przeciwbakteryjne
do porównania działania przeciwbakteryjnego opatrunków zastosowano metodę dyfuzji agaru. Próbkę (1 cm2) każdego opatrunku inkubowano na świeżo zaszczepionej szalce Petriego Staphylococcus aureus lub Pseudomonas aeruginosa; szczepy te wyizolowano z ludzkich przewlekłych ran, scharakteryzowano i hodowano zgodnie z opisem poprzednio.52 Dodatkowo porównano skuteczność przeciwdrobnoustrojową ekstraktów opatrunkowych (przygotowanych w pożywce RPMI z 10% FBS, jak opisano powyżej) za pomocą metody mikrodylucji53. Gęstość optyczną mierzono za pomocą wielomodowego czytnika płyt Ensight (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) przy 600 nm przez 24 godziny (wstrząsanie, 37 °C).
Kultury komórkowe
normalne ludzkie fibroblasty skórne ze skóry dorosłej (nhdf) zostały zakupione w Lonza (Bazylea, Szwajcaria). NHDF hodowano w zmodyfikowanym Orliku Dulbecco low glucose medium (dmem) uzupełnionym 10% FBS, glutaminą (0,3 mg/mL), glukozą (4 mg/mL), penicyliną (100 jednostek/mL) i streptomycyną (0,1 mg/mL) w kolbach hodowli o powierzchni 75 cm2 poniżej 5% CO2 i w temperaturze 37 °C do piątego przejścia. Keratynocyty HaCaT zostały zakupione w Hölzel Diagnostika (Köln, Niemcy) i były uprawiane w ten sam sposób, ale bez dodatku glukozy do pożywki.
pomiar żywotności
pięć tysięcy komórek na studzienkę wysiewano w 96-studzienkowej płytce z 200 µL pożywki hodowlanej z 10% FBS w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez noc. Następnego dnia komórki potraktowano 200 µL serii rozcieńczeń ekstraktów z opatrunków (100%, 50%, 20%, lub 10% oryginalnego ekstraktu rozcieńczonego pożywką hodowlaną uzupełnioną 10% FBS) przez 24, 48 i 72 godziny. Komórki kontrolne leczono standardowym podłożem hodowlanym 10% FBS. Żywotność mierzono w sposób opisany poprzednio 54 przy użyciu testu bromku 3-(4, 5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylo-tetrazolium (MTT). Do podłoża hodowli komórkowej w każdej studzience dodano podstawowy roztwór MTT (20 µL; C = 5 mg/mL). Płytki inkubowano przez 2,5 h w temperaturze 37 °C. następnie usunięto roztwór MTT, dodano 220 µL roztworu lizy (1:1 propan-2-ol z DMSO, 10% (w/v) Triton X-100 i 0,37% (w/V) HCl) i przeprowadzono lizę przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce obrotowej (150 obr. / min). Absorbancję odczytywano przy 570 i 690 nm za pomocą wielomodowego czytnika płytowego EnSight (PerkinElmer, USA). Dane były przetwarzane w Kaleido (PerkinElmer, USA). Absorbancja końcowa została obliczona jako a = A570-A690. Zmianę żywotności leczonych komórek w stosunku do komórek kontrolnych obliczono jako zmianę = (próbka/kontrola – 1) × 100.
test hamowania bezpośredniego kontaktu
komórki wysiewano z gęstością 300 000 komórek na studzienkę w 6-studzienkowej płytce i inkubowano w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 37 °C i poniżej 5% CO2, aż do osiągnięcia zbiegu. Opatrunki pocięto na kwadraty o powierzchni 1 cm2, umieszczono na warstwie komórkowej i inkubowano ze standardowym pożywką hodowlaną przez 6 godzin. komórki kontrolne traktowano tylko pożywką. Następnie komórki przemyto PBS i utrwalono 4% paraformaldehydem przez 15 minut. Komórki barwiono 0,1% (w/v) roztworem fioletu krystalicznego (rozpuszczonym w 10% etanolu) przez godzinę, a następnie przepłukano wodą. Zdjęcia wykonano aparatem cyfrowym Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
fluorescencyjne barwienie komórek
w celu analizy uszkodzeń DNA, komórki NHDF były wysiewane na mikroskopijnych szkiełkach do 6-studzienkowej płytki o gęstości 2 × 105 na studzienkę i pozostawiono do przylegania przez noc. Następnego dnia komórki traktowano 5 × rozcieńczonymi ekstraktami opatrunkowymi i inkubowano przez 24 godziny. następnie komórki utrwalano za pomocą 4% PFA przez 15 minut. Po permeabilizacji i blokowaniu, szkiełka inkubowano z pierwotnym przeciwciałem królika anty-yH2AX (Cell Signaling, US; rozcieńczenie 1: 500 w buforze blokującym—20% FBS, 0,3 m glicyny, 0,05% Tween 20 w PBS; przez noc; 4 °C). Wykrywanie przeprowadzono stosując przeciwciało wtórne znakowane Alexa Fluor 555(Abcam, UK; 1:500 w buforze blokującym; 1 h, RT). Prowadnice zostały zamontowane przy użyciu ProLong Diamond Antifade Mountant z DAPI (ThermoFisher Scientific). Po wysuszeniu szkiełek zdjęcia wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Ti Eclipse (Nikon, Yokohama-Shi, Japonia).
wewnątrzkomórkowy stres oksydacyjny wykryto za pomocą sondy DCF-DA, która jest wrażliwa na ogólne stężenie ROS wewnątrz komórek. Komórki wysiewano przez noc w 24-studzienkowej płytce, a następnie znakowano DCF-DA (1 µg / mL) przez 15 minut, po czym poddano działaniu 5 × rozcieńczonych ekstraktów opatrunkowych i inkubowano w temperaturze 37 °C i poniżej 5% CO2. 5 mM H2O2 zastosowano jako kontrolę dodatnią. Zieloną fluorescencję DCF rejestrowano co 15 minut podczas 90-minutowego okresu inkubacji przy użyciu automatycznego mikroskopu Incucyte S3 (Essen Bioscience, USA). Kwantyfikację wewnątrzkomórkowej fluorescencji przeprowadzono w oprogramowaniu Fiji według metody opisanej przez Čepa55.
oznaczanie rozerwania oksydacyjnego przez neutrofile we krwi pełnej
niezależny komitet etyczny zatwierdził pobranie próbki krwi do testu rozerwania oksydacyjnego neutrofili i MAT (Komitet etyczny ds. badań na Uniwersytecie Masaryka w Brnie, Czechy, aprobata nr. EKV-2018-083). Wszyscy dawcy wyrazili na to pisemną zgodę.
wybuch oksydacyjny (produkcja ROS) fagocytów krwi oznaczano w rozcieńczonej krwi pełnej za pomocą chemiluminescencji wzmocnionej luminolem (CL) przy użyciu luminometru mikropłytowego lm-01T (Immunotech, Republika Czeska). Krótko mówiąc, mieszanina reakcyjna składała się z 6 µL pełnej krwi w 54 µl pożywki wzrostowej rpmi-1640 zmieszanej z 60 µl ekstraktu opatrunkowego w soli fizjologicznej lub pożywce uzupełnionej FBS. Mieszaninę tę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Tuż przed rozpoczęciem pomiaru dodaliśmy 1 mM luminolu (roztwór podstawowy 10 mM luminolu w buforze boranowym 0,2 M) (sondy molekularne, USA). Oznaczono spontaniczną produkcję ROS i produkcję ROS indukowaną przez opsonizowane cząstki zymosanu (OZP-0,1 mg / mL) (Sigma-Aldrich, USA) lub octan 12-mirystynianu forbolu (PMA-0,8 µM; Sigma-Aldrich, USA). Nieprzetworzone próbki bez badanych ekstraktów oceniano jako kontrole. Testy przeprowadzono w duplikatach. Chemiluminescencję zapisywano w sposób ciągły przez 90 minut w temperaturze 37 °C i wyrażano jako względne jednostki światła (RLU). Całkowitą ilość produkcji ROS określiliśmy z obszaru zintegrowanego pod krzywą chemiluminescencji.
test aktywacji monocytów (mat)
mat przeprowadzono w 10-krotnej ludzkiej pełnej krwi rozcieńczonej solą fizjologiczną. Próbki krwi pobrano od pięciu zdrowych dawców, połączono i rozcieńczono solą fizjologiczną. Rozcieńczone próbki krwi inkubowano z kręgów o średnicy 6 mm wyciętych z opatrunków w sterylnych mikrotubkach przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. równolegle, lipopolisacharyd (LPS, końcowe c = 0. 25 J. M./mL; endotoksyny Standard E-Toxate; Sigma, US) dodano do drugiej serii próbek inkubowanych z próbkami opatrunkowymi w celu stymulowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na bakterie. Komórki krwi sedymentowane podczas inkubacji, pozostawiając górną fazę osocza rozcieńczonego solą fizjologiczną. Po inkubacji pobrano 200 µL każdej próbki osocza rozcieńczonego solą fizjologiczną i natychmiast oznaczono w duplikatach IL-6 za pomocą niepowlekanego zestawu ELISA IL-6, zgodnie z protokołem producenta (ThermoFisher Scientific, US). Absorbancję odczytano za pomocą wielomodowego czytnika płytowego EnSight (PerkinElmer, US), A końcowe stężenie IL-6 obliczono za pomocą Kaleido SW (Perkin Elmer, US). Pozostałe osocze i sedymentowane komórki przechowywano w temperaturze 4 °c w celu oceny hemolizy i toksyczności.
hemolizę
wykryto w pozostałym roztworze soli fizjologicznej osocza i komórkach sedymentowanych z MAT. Po odwirowaniu 100 µL każdej próbki przeniesiono do 96-studzienkowej mikropłytki i mierzono absorbancję przy 550 nm. 1% Triton X-100 zastosowano jako kontrolę pozytywną.
uwalnianie LDH
toksyczność opatrunków srebrnych dla komórek krwi oceniano za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (wykrywanie cytotoksyczności KitPLUS, Roche, Szwajcaria) zgodnie z instrukcjami producenta. Wykorzystano dwa źródła komórek krwi – ludzką krew pełną inkubowaną ze srebrnymi opatrunkami jak w matach oraz izolowane neutrofile. Absorbancję wykorzystywaną do korekcji tła mierzono w ślepych próbkach bez odczynnika LDH. Wyniki podaje się jako bezwzględne wartości gęstości optycznej w porównaniu do nieobrobionej próbki.
analiza statystyczna
Jeśli nie stwierdzono inaczej, Test T ucznia został użyty do oceny istotności statystycznej różnic między próbkami a nieleczonymi grupami kontrolnymi.