a Identificação de atenuação e antitermination regulamento em procariotas

Caracterização de atenuadores em B. subtilis e escherichia coli

Uma extensa literatura de pesquisa para operons em B. subtilis regulamentado pela atenuação ou antitermination foi realizado e 46 tais operons foram encontrados. Estes variam desde o operão trp experimentalmente bem descrito até aqueles operões onde estruturas terminadoras foram encontradas e a atenuação é esperada embora não bem caracterizada experimentalmente (para uma lista completa veja http://www.bork.embl-heidelberg.de/Docu/attenuation). Estas 46 estruturas terminadoras conhecidas foram empregadas para determinar características comuns dos terminadores de atenuação B. subtilis. Utilizando estas características, examinámos regiões a montante de 3650 B. genes subtilis (utilizando procedimentos descritos em materiais e métodos) para dobras terminatórias. Quarenta e três dos 46 terminadores originais encontrados na pesquisa literária foram mantidos nesta exibição. Foram também obtidas mais 1117 dobras a montante que se encaixam nos nossos critérios. Além disso, como um controle, nós usamos a mesma metodologia de filtragem e dobragem em regiões intergênicas depois que as sequências foram baralhadas aleatoriamente (952 dobras de sequências baralhadas aleatoriamente foram obtidas após filtragem).

as dobras resultantes de todas as regiões intergénicas e sequências baralhadas obtidas após filtragem foram plotadas em termos de estabilidade e comprimento (Figura 1). O terminador conhecido dobra em um aglomerado claramente separado e distinto daquelas dobras de sequências baralhadas aleatoriamente. Dobras terminadoras são de uma menor energia livre (ΔG) em relação ao comprimento do que dobras previstas de sequências aleatórias. Um padrão semelhante de dois clusters facilmente separados emerge quando se compara estruturas terminadoras conhecidas com regiões intragênicas dobradas nas quais não se espera que o terminador seja encontrado (dados não mostrados).

Usando a análise principal dos componentes, determinámos a maior variância das sequências baralhadas aleatoriamente. Isto pode nos dar uma medida (usando o desvio padrão) da qual dobras são significativamente diferentes de dobras de sequências aleatórias (ver materiais e métodos). Das 1160 dobras, um total de 203 dobras de regiões intergênicas obtidas em nossa tela caem abaixo da segunda linha de desvio (Z ≤ -2) derivada do componente principal. Estes são, portanto, considerados significativamente diferentes de dobras aleatórias e possíveis terminações locais de regulação da atenuação ou anti-determinação. Quarenta e dois destes são os terminadores de atenuação conhecidos dobram (das 43 dobras conhecidas originais mantidas após filtragem). Assim, podemos obter 91,3% (42/46) dos locais conhecidos e caracterizados experimentalmente de atenuação e antiterminação, usando o nosso filtro e medida de significância. Além disso, o filtro e o significante medem telas em mais de 97,7% (930 de 952) das dobras de sequências aleatórias. Cento e sessenta e um (203 total excluindo 42 conhecidos) dobras sob a linha (Z ≤ -2) são dobras ainda não analisadas experimentalmente e pode ser previsto para ser estruturas de atenuação terminator.

uma investigação detalhada descobriu que muitas destas previsões são fortemente apoiadas como locais de atenuação putativa ou anterminação por contexto genômico, tais como a presença de sequências de promotores putativos, localização a montante de operões putativos e conhecidos, etc. Duas estruturas terminadoras de genes upstream ydbJ e yqhI servem como exemplos detalhados de como o contexto genômico pode informar e apoiar fortemente as previsões feitas na Tabela 1 (Figura 2). Gene ydbJ of B. subtilis is listed as hypothetical with homology to an ABC transporter gene (ATP-binding protein involved in copper transport). O gene imediatamente abaixo, ydbK, tem homologia para membrana permeases. Usando a SEQÜÊNCIA de caracteres (uma ferramenta de pesquisa para encontrar o recorrente instâncias de vizinhos genes ), ortólogos’destes dois genes também são encontrados na mesma ordem em unidades de transcrição de 15 outros aparentados genomas, sugerindo a possibilidade de estes genes formam um operon. Estes genes parecem estar em uma configuração típica de operão de transportador ABC e vários operões de transporte ABC são conhecidos por serem regulados pela atenuação em B. subtilis . A região ydbJ upstream também tem uma sequência de promotor putativo e predicted folds usando RNAfold (ver materiais e métodos) de toda a sequência upstream sugerem que pode dobrar em complexas dobras anti-determinação possíveis (dados não mostrados). Baseado neste contexto, prevemos que este é um transportador ABC regulado pela atenuação. O segundo exemplo, yqhI, é o primeiro gene de uma série de três genes todos com homologia para genes de biossíntese glicina em uma unidade de transcrição putativa. Esta série de três genes também tem ortólogos encontrados como vizinhos em outros genomas . Muitos operadores de biossíntese de aminoácidos em B. subtilis são conhecidos por serem regulados pela atenuação , apoiando assim esta previsão.

para verificar se os padrões observados mantenha só os outros genoma em que a atenuação ou antitermination é bem estudado e experimentalmente descrito, nós também aplicou a mesma metodologia para a montante regiões de genes no genoma de E. coli para que 16 operons tem sido descrito como sendo regulamentado através de atenuação ou antitermination. Como pode ser visto na Figura 3, as estruturas conhecidas de atenuação e Exterminador de E. coli têm propriedades semelhantes às de B. subtilis. 15 dos 16 atenuadores conhecidos foram mantidos após filtragem. A medida de significância separa 14 destes terminadores de E. coli de dobras aleatórias, como se vê na Figura 3. Como em B. subtilis, usando a linha (Z≤-2) como medida de significância, somos capazes de prever a atenuação para 146 regiões (Figura 3 e Tabela 2).

a Extensão da análise para 26 de genomas

a Análise de B. subtilis e E. coli sugere que um levantamento mais amplo de genomas bacterianos pode ser útil tanto na previsão de regulação da atenuação e anti-determinação nestes genomas e na caracterização da evolução e distribuição destes mecanismos de regulação. Vinte e quatro genomas completados foram selecionados para esta pesquisa com base em sua ampla distribuição ao longo do espectro evolucionário (Tabela 3). As regiões intergênicas de cada um destes genomas foram analisadas usando os mesmos métodos e filtros que com B. subtilis e E. coli e predicted atenuation and antitermination terminator folds similarly obtained.

Conforme mostrado na Tabela 3, há uma ampla distribuição do número de putativo atenuação e antitermination regulamentar sites pesquisados genomas. Estes variam entre 5 no Mycobacterium tuberculosis e 275 no Clostridium acetobutylicum (Quadro 3). Tentativas anteriores de predizer os locais de terminação de transcrição padrão no final das unidades de transcrição dão resultados semelhantes. Curiosamente, os resultados para terminadores de transcrição padrão estão correlacionados com os nossos. Como foi encontrado em Ermolaeva et. al com o padrão de terminadores no final da transcrição (unidades este papel estudou terminadores no final de ORFs e não alvo montante regiões, assim filtragem de possíveis atenuadores), alguns com o maior número de ocorrências de atenuação e antitermination sites em nossa pesquisa são igualmente encontrados no genoma de E. coli, H. influenze, D. radiodurans and B. subtilis and the lowest number of occurrence in such genomes as H. pylori, and M. tuberculosis (genomes reported in their survey).

à primeira vista, isto parece sugerir que muitos genomas não usam os mesmos mecanismos de terminação para a terminação de transcrição padrão e não usam atenuação ou anti-determinação na regulação. Este é provavelmente o caso em alguns genomas. No entanto, se o número de regiões intergênicas a montante for representado em relação ao número de locais previstos, é mostrada uma forte correlação positiva (Figura 4). Quanto menor for o número de genes e regiões intergênicas que um genoma tem, menor será a ocorrência de terminadores preditos (tanto terminadores de transcrição padrão quanto terminadores regulatórios de atenuação/anti-determinação). Isso indica que o baixo número de padrão de terminação e regulamentares terminação em muitos genomas é devido a uma grande redução de tamanho do genoma e a redução do número de regulamentar operons, e não necessariamente à dependência de diferentes mecanismos de rescisão de contrato e regulamento.

há um outlier claro com um número muito inferior ao esperado de terminadores putativos vistos na Figura 4, Mycobacterium tuberculosis. Este genoma tem uma ocorrência muito menor de locais de atenuação putativa e antiterminação do que seria sugerido pelo seu tamanho e o número de regiões intergênicas. A recent paper by Unniraman et al. conclui que M. tuberculosis usa um mecanismo diferente de terminação que utiliza estruturas terminadoras sem a cauda poli-U necessária em outros genomas. Assim, a redução do número de estruturas terminadoras contendo poli-U em relação ao número de regiões intergénicas pode ser explicada pela dependência de M. tuberculosis num mecanismo diferente de terminação. Isto não prova necessariamente que não haja regulação do tipo de atenuação ou anti-determinação em M. tuberculosis. No entanto, indica que a perda do mecanismo padrão de terminação neste genoma reduziu se não eliminou a atenuação ou a anti-determinação em M. tuberculosis ou, alternativamente, um mecanismo semelhante à atenuação pode existir neste genoma que utiliza o M. tuberculose não é o Exterminador padrão.todos os outros 25 genomas estudados possuem locais de regulação da atenuação putativa ou anti-determinação. Mesmo o menor número de previu a atenuação ou antitermination sites encontrados em M. genitalium em uma proporção significativa de possíveis regulamentar intergenic regiões, o baixo número é facilmente explicada por esse genoma relativamente pequeno tamanho e alguns intergenic regiões e unidades de transcrição. Estes resultados sugerem que a regulação da atenuação e da anti-determinação é possivelmente um mecanismo ubíquo de regulação em procariontes, com poucas exceções.

tamanho do genoma e atenuação

Se o conteúdo de GC de um genoma for comparado com o número de atenuadores previstos com base em sequências baralhadas aleatoriamente, o conteúdo de GC correlaciona-se um pouco com o número de atenuadores previstos, o que seria esperado uma vez que uma execução de poli-U é necessária nos filtros. Na figura 5a, dobras de sequências intergênicas baralhadas aleatoriamente de nossos 26 genomas foram plotadas pelo número de dobras filtradas por região intergênica em relação ao número de regiões intergênicas. Se o número de dobras filtradas fosse completamente aleatório, deveria haver um número relativamente constante de locais por região em relação ao número de regiões. Tal como se vê na figura 5a, não é inteiramente o caso. O número de dobras filtradas por região obtidas a partir de sequências baralhadas aleatoriamente depende do conteúdo GC do genoma. Os genomas de baixo teor de GC têm um número ligeiramente superior de dobras por região do que os genomas de cerca de 50% de conteúdo de GC e os genomas de alto teor de GC têm um número muito menor do que ambos. Isto é esperado a partir de sequências aleatórias filtradas para estruturas de laço-tronco contendo circuitos poli-U.

mesmo tendo em conta o teor de GC de M. tuberculosis, apresenta um número reduzido de atenuadores previstos em relação aos outros genomas de alta GC (figura 5b). Na verdade, a figura 5b (atenuadores previstos de sequências intergênicas reais) mostra que o determinado mais forte do número de atenuadores previstos por região intergênica não é o conteúdo de GC, mas sim o tamanho do genoma (mais especificamente o número de regiões intergênicas). Em geral, não só os genomas maiores têm um maior número absoluto de atenuadores previstos, mas têm uma maior ocorrência de atenuadores previstos por região. Se o conteúdo de GC é igual em dois genomas, o genoma maior é mais provável que tenha um maior número de atenuadores previstos por região intergênica. Relatórios anteriores têm sugerido fenômenos semelhantes em proteínas regulatórias, genomas grandes parecem ter uma maior proporção de seu número total de genes que codificam proteínas que contêm motivos regulatórios . Curiosamente, descartando as archaebacteria e os genomas de alto teor de GC, um genoma de cerca de 1500 regiões intergênicas parece ser o limiar em que a frequência de atenuadores regulatórios aumenta em um genoma.foram analisados sete genomas de bacterias gram-positivas (B. subtilis, B. halodurans, l. innocua, S. aureus, C. acetobutylicum, L. lactis, E S. pneumoniae) para verificar se os terminadores de atenuação são conservados em frente aos ortólogos. O número de terminadores de atenuação previstos para os genes que se sabe serem regulados em B. subtilis e seus ortólogos nos outros seis genomas estão listados na Tabela 4. Os genomas são classificados por distância filogenética de B. subtilis calculada por sequências de aminoácidos dos ortólogos compartilhados entre estes genomas. O mais próximo do B. subtilis é B. halodurans e o número médio de substituições de aminoácidos por local é 0,238, e o mais distante é S. pneumoniae e o número médio de substituições de aminoácidos por local é 0,422. Para o 42 genes listados na Tabela 4, o número de ortólogos’que são encontradas nos outros genomas variam pouco do genoma ao genoma: o maior e O menor número de ortólogos’31 em L. lactis e 26 em S. aureus e C. acetobutylicum, respectivamente. Isto ocorre principalmente porque estes 42 genes carregam algumas funções básicas, como a síntese aminoacil-tRNA. Por outro lado, o número de estruturas de terminação de atenuação previstas varia significativamente: em B. halodurans, 22 genes ortólogos previram estruturas de terminação de atenuação, enquanto apenas 4 genes ortólogos têm as estruturas previstas em S. pneumoniae. Isto indica que a ausência ou presença de regulação por atenuação é muito mais fraca conservada do que a presença do gene ou dos operons.

conservação das estruturas de terminação de atenuação previstas também é observada nas regiões a montante do possível operão que contém o gene nusA (figura 7a). Quatro dos sete genomas contêm estruturas de atenuação previstas a montante da proteína hipotética (ilxs em B. subtilis). Estruturas de laço-tronco também são encontradas no resto dos três genomas, embora estas estruturas não passam pelos filtros. A localização das estruturas para o local de início da transcrição do gene e sequências em si variam significativamente neste exemplo também. Nestas sequências de caule, o segmento GUGGG (GAGCG em L. lactis e GAGGC em S. pneumoniae) é conservado no operão previsto que contém o gene nusA (figura 7b). Curiosamente, os segmentos de 5 bases são idênticos ou muito semelhantes aos segmentos das estruturas de stem-loop localizadas a montante do infC (figura 6b). As proteínas codificaram os genes nestes dois operões estão envolvidas na transcrição. A conservação dos segmentos de sequência nas estruturas de atenuação previstas para o operão infC-rpmI-rplT e o operão que contém nusA implica que existe um mecanismo regulamentar comum que reconhece a estrutura de laço-tronco e que regularia os dois operões da mesma forma.

de Distribuição e Conservação de Atenuadores em Proteobacteria

Vários aspectos da conservação de atenuadores são imediatamente aparentes a partir de nossa análise de bactérias gram-positivas . Em primeiro lugar, a distribuição da regulação da atenuação ou anti-determinação não é bem conservada através da baceria gram-postiva e, adicionalmente, mesmo em sistemas regulatórios conservados, a sequência e conservação da estrutura é fraca. O mesmo se aplica às proteobactérias. Dos 14 genes em E. coli (ver Quadro 5a) conhecido por ser regulado por atenuação ou anti-determinação, nenhum tem atenuadores previstos ortólogos a montante em todos os outros quatro genomas proteobactérias. Seis têm atenuadores preditos em ortólogos upstream em pelo menos um dos outros quatro genomas. Três são genes que têm ortólogos em todos os outros quatro genomas, mas estes não têm atenuadores previstos. Os restantes cinco genes na E. coli não têm ortólogos conhecidos no outro genoma ou ortólogos têm uma distribuição irregular e não têm atenuadores previstos. Uma inspecção minuciosa à mão confirma esta conclusão. A tabela 5b é uma lista de todos os atenuadores previstos em cada um dos cinco genomas da divisão gama de proteobactérias em que um atenuador similar é previsto para um ortolog de outro genoma. Como mostrado nesta tabela, a atenuação e a anti-determinação parecem ser mal conservadas como um mecanismo de regulação em operões análogos em genomas proteobacterianos. Do total de 475 genes e suas ortólogos’nestes cinco genomas que o previsto atenuadores, apenas 36 são compartilhados montante ortólogos’de dois ou mais genomas (Tabelas 3, 5a e 5b).