a Identificação de Bordetella pertussis em um Criticamente Doentes, o Vírus da Imunodeficiência Humana-Pacientes Infectados pelo Direta Genotypical Análise de Grama Manchada de Material e Discriminação de B. Holmesii através da utilização de um único local enzimático de restrição genética recA

a identificação de bactérias a partir de amostras clínicas é feita, em grande parte, por caracterização fenotípica após cultura e microscopia in vitro. Não é incomum, no entanto, preparações diretamente manchadas por grama revelam muitos organismos, mas as culturas não conseguem demonstrar um patógeno. Isto foi ilustrado num caso clínico recente, no qual um homem de 48 anos com SIDA foi admitido com coccidioidomicose pulmonar. Apesar da terapia antifúngica, o seu estado não melhorou. Amostras de Sputum revelaram muitos bacilos gram-negativos em microscopia direta, mas sem patógenos na cultura. Além disso, várias culturas de sangue cresceram hastes gram-negativo fastidiosos, que não podiam ser especiados por métodos convencionais.

decidimos tentar a identificação dos dois isolados por métodos genotípicos usando primadores de oligonucleótidos universais destinados ao pequeno gene rRNA (16S rRNA). A partir das amostras respiratórias, no entanto, apenas diapositivos Gram-stained estavam disponíveis. Desenvolvemos, portanto, um novo método, no qual o DNA bacteriano é recuperado diretamente do slide manchado por grama. As lâminas eram Gram manchadas pela metodologia tradicional (12). Uma lâmina de vidro transparente foi manchada com amostras e tratada com metanol absoluto (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), seguido de fixação térmica a 65°C e tratamento com solução de violeta cristal (Remel, Lenexa, Kans.). A lâmina foi ainda tratada com iodo de Gram (Remel), descolorizada com solução de álcool-acetona (3:1), e contrastada com safranina (Remel). O óleo de imersão foi primeiramente removido do slide com 100% de xileno (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) seguido de lavagem em etanol a 100%. Em seguida, o material foi descartado com uma lâmina de barbear reta, suspensa em 50 µl de solução de hidratação de DNA de Puregeno (Gentra, Minneapolis, Minn.), indexado, e fervido por 10 minutos. Para a análise do isolado de sangue, foi utilizado material tanto do frasco BACTEREC como de colónias cultivadas em meio sólido. A PCR subsequente foi realizada num volume de 50 µl contendo 5 µl do modelo, 1,5 mM MgCl2, 100 µM cada trifosfato de desoxinucleósido (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U de Taq DNA polimerase (Roche Diagnostics Corporation), e 0.15 µM (cada) universal 16S rRNA primers 11E (5′-GAGGGGGATGACG-3′) E 13B (5′-TCCGGCCCTTTGCATAAGTG-3′), conforme descrito anteriormente (15). Após uma etapa de desnaturação de 5 minutos a 94 ° C, passos PCR de 94°C Para 60 s, 50°C Para 60 s, e 72°C para 90 s foram repetidos 30 vezes em um sistema Perkin-Elmer GeneAmp PCR 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Os produtos foram obtidos tanto a partir de saliva como de sangue (Fig. 1). Estes foram purificados com o kit de purificação QIAQUICK PCR (Qiagen Inc., Valencia, Calif.), and DNA sequencing was performed on an Applied Biosystems ABI3100 sequencer (HHMI Biopolymer/W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine). A comparação subsequente com a base de dados pública (GenBank) by BLAST (1) identificou o isolado de sangue como Helicobacter cinaedi ou Helicobacter rappini. Ambos os organismos têm sido associados a bacteremias em doentes imunocomprometidos (9, 10, 13, 16, 17). O produto PCR do isolado respiratório corresponde aos genes rRNA 16S de Bordetella pertussis e Bordetella holmesii, que são 99,5% homólogos e idênticos na região amplificada (18).

A fim de especializar o isolado respiratório de Bordetella e validar o resultado da análise genotípica, foi desenvolvido um ensaio discriminatório no qual uma parte do gene recA (6, 7), que contém um único local de restrição enzimática, foi alvo. Amplification of B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) e B. holmesii (ATCC 51541), bem como o ADN da coloração do Gram do sputum do nosso paciente, foi realizado como descrito acima, excepto que 3 mM MgCl2 e primers específicos recém-concebidos (para a frente, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; e o inverso, 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3′) foram utilizados e a PCR passos (94°C por 30 s, 59°C por 30 s e 72°C por 60 s) foram repetidas 45 vezes seguido por um final de alongamento passo a 72°C. os Produtos foram digeridos com NciI de acordo com as recomendações do fabricante (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.). Os dois organismos podem ser facilmente distinguidos porque B. holmesii tem dois locais NciI, enquanto B. pertussis e todos os outros Bordetella spp. apenas tem um site NciI dentro da região amplificada. O isolado de sputum foi posteriormente identificado como B. pertussis(Fig. 2) e foi notificado como um agente patogénico oportunista pulmonar em doentes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (4, 5).investigámos em seguida se a identificação genotípica de organismos directamente a partir de preparações clínicas de coloração Gram com primários universais é um método viável e reprodutível. O tipo de fixação (calor, 100% de metanol e 100% de etanol) e a presença de restos de corantes após coloração Gram, como descrito acima, não interferem com a PCR. Um limite de detecção de 1.500 UFC/µl de sputum (6 a 30 organismos por campo de imersão em óleo) foi encontrado, o que é semelhante a outros relatórios (14). Para este achado, três clínicos aleatórios amostras de escarro com bactérias no Gram ou cultura foram agrupados, misturado com quantidades definidas de Escherichia coli (ATCC 25922), fixo e Gram manchado, e raspar a apresentação, como descrito acima. Foram testadas várias amostras clínicas escolhidas aleatoriamente e, quando um organismo predominante era visível ao microscópio, a sua identificação correspondia ao agente patogénico cultivado (Quadro 1). o nosso método tem várias vantagens em relação aos ensaios anteriormente descritos. Ao contrário de relatórios anteriores, em que o ADN é primeiramente extraído do sputum e primers específicos da espécie são usados (2, 11, 14, 19, 20), o nosso ensaio utiliza ADN recuperado directamente de lâminas Gram-manchadas sem passos de extracção e utiliza primers universais, permitindo assim a identificação de uma vasta gama de bactérias com um protocolo simples. Como mostrado, isso pode ser alcançado mesmo na presença de flora residente de fundo normal porque o número de ciclos de PCR é limitado, permitindo assim a amplificação competitiva do DNA bacteriano. Uma vez que a qualidade da amostra submetida e as proporções relativas de micróbios morfologicamente diferentes podem ser facilmente determinadas com manchas de Grama, podem ser selecionados esfregaços adequados antes da amplificação do DNA. Além disso, a aparência Gram mancha do organismo predominante serve como um controle interno de qualidade após a identificação genotípica. Tal como acontece com a identificação fenotípica, os resultados do nosso ensaio têm de estar correlacionados com o quadro clínico antes de serem tomadas decisões de tratamento, uma vez que nenhum dos métodos pode distinguir fiavelmente entre colonização e infecção.

entre os poucos relatórios na literatura em língua inglesa que descrevem a recuperação de ácido nucleico de amostras clínicas em lâminas de vidro (3, 8), Nenhum até agora descreveu a amplificação do DNA após a recuperação de bactérias de lâminas Gram-manchadas. Nosso método é rápido e confiável e pode ser usado como uma ferramenta nos casos em que os organismos são vistos em abundância em lâminas de Gram manchadas clínicas, mas não pode ser recuperado na cultura. A técnica pode ser particularmente útil quando um diagnóstico é procurado retrospectivamente ou após as amostras originais terem sido descartadas.

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