o seu conselheiro diz-lhe que quer que use HPLC para analisar o seu composto. Sabes que já ouviste falar desta técnica antes, mas não te lembras do que a HPLC representa, quanto mais como fazê-lo! Já todos estivemos lá, e aposto que gostavas de ter prestado mais atenção naquela palestra!
não tenha Medo – nesta série de artigos eu vou lembrá-lo sobre o poder da coluna de HPLC 🙂
neste primeiro artigo, vou levá-lo através do princípio por trás de HPLC e lembrá-lo de seus usos – você vai estar pronto para o laboratório em nenhum momento!como funciona a HPLC?
cromatografia líquida de alta resolução, ou HPLC, é um nome Longo para uma técnica poderosa baseada no simples fato de que os compostos individuais se comportam de forma diferente na água.HPLC separa e purifica compostos de acordo com sua polaridade, ou sua tendência a gostar ou não de água. Para contextualizar a polaridade, considere que o óleo é um líquido apolar que não se mistura com água. O etanol, por outro lado, é polar e, como muitos de vocês sabem, mistura muito bem com água (Vodka e Coca-qualquer um??).
I have tried to simplify the whole process in Figure 1 below, but first let’s look at the main components involved in HPLC. Peço desculpa antecipadamente por algum jargão inevitável!
os componentes
a coluna de HPLC
Esta é também conhecida como a fase estacionária. Este é o cavalo de trabalho da máquina HPLC, é feito de uma de uma variedade de substâncias (muitas vezes sílica) e é muito compacto na natureza. As partículas de sílica são funcionalizadas por longas cadeias de carbono. As cadeias de carbono são apolares e, portanto, quanto mais longa a cadeia, mais apolar a coluna se torna. Colunas contendo 18 cadeias de carbono são comumente usadas e são conhecidas como colunas C18.
A amostra de HPLC
os tipos de amostra variam muito dependendo do campo e do tipo de compostos em questão. HPLC pode ser usado para analisar compostos em espécimes biológicos (urina, sangue, saliva e músculo), amostras ambientais, química medicinal (drogas), e Microbiologia (toxinas produzidas por fungos e bactérias).as amostras são injectadas na coluna da HPLC. Isto costumava ser feito manualmente, o que significa que alguma pobre alma teve que sentar-se ao lado da máquina HPLC durante horas a fio, injetando cada amostra com uma seringa, às vezes toda a noite!
Felizmente, os modelos mais recentes têm um injector automático, reduzindo a entrada manual e permitindo maior rendimento. As máquinas modernas são equipadas com software que permite ao Utilizador introduzir uma lista de amostras, quanto e em que Ordem devem ser injectadas. Para que você possa desfrutar do seu almoço enquanto o seu HPLC funciona sozinho!
a fase móvel
é, na verdade, apenas uma mistura de água e um solvente orgânico (geralmente acetonitrilo ou metanol). A fase móvel recebe o nome porque se move através da coluna e ao mesmo tempo eluta (ou descarrega) os compostos da coluna.os compostos são frequentemente eluídos ao longo de um gradiente de concentração. Se és como eu, concentração e gradiente são duas palavras que detestas ver juntarem-se numa frase! Isso significa apenas que a porcentagem de água na fase móvel diminui ao longo do tempo, enquanto a porcentagem do solvente apolar aumenta simultaneamente. Isto significa que a fase móvel gradualmente se torna mais apolar. Não se preocupe muito com gradientes por agora, pois eles aparecerão novamente em um artigo de acompanhamento.
a execução de HPLC
HPLC pode ser realizada em vários modos. O método mais comumente usado é conhecido como fase invertida (RP-HPLC) e isso é o que eu descrevo aqui. Neste modo, os compostos são separados começando com os mais polares, e terminando com os compostos apolares. Para todos os modos, uma bomba de alta potência move a amostra e a fase móvel através da coluna. Uma corrida típica pode levar entre 10-60 minutos.
o princípio por trás de HPLC – um olhar mais atento
Agora que você tem uma idéia dos componentes envolvidos, vamos avançar para o princípio em um pouco mais de detalhe.I mentioned above that HPLC separates compounds on the basis of polarity. Mas como é que isto funciona? Em inglês, por favor! À medida que o gradiente entra em acção, a concentração do solvente aumenta enquanto a concentração da água diminui. Isso torna a fase móvel cada vez mais apolar. Os compostos contidos na amostra colam-se às cadeias de carbono na coluna, com os compostos mais apolares colando os mais fortes, e os mais polares colando-se de forma fraca.a Figura 1 mostra o que acontece a uma amostra que contém uma mistura de compostos após a injecção na coluna. Os compostos ligam-se à coluna e são despejados em momentos diferentes, dependendo se eles são mais propensos a aderir à coluna ou à fase móvel como ele é bombeado através. O tempo que cada composto eluta (ou descarrega) da coluna é conhecido como o tempo de retenção do composto (Rf).
Figura 1: O princípio por trás de HPLC
Figura 1: Compostos de diferentes polaridades (indicado como escurecimento tons de azul) são injetadas na coluna de HPLC (cilindro inteiro). A fase móvel é bombeada através da coluna, e a adição de solvente ao longo de um gradiente de concentração (mostrado como uma linha pontilhada a preto) diminui continuamente a polaridade geral da fase móvel (eixo Y). Os compostos são capazes de manter a coluna ou a fase móvel, dependendo de como são polares. Os compostos eventualmente se agarram à fase móvel quando sua polaridade coincide com a fase móvel. Eles serão então dissociados da coluna e serão eludidos em um momento particular (eixo X) durante a execução. Desta vez é conhecido como Rf para aquele composto.
compreender a saída
a saída ou resultados de uma execução de HPLC é geralmente visto como um cromatograma (Figura 2). Trata-se de uma série horizontal de picos representando compostos eluídos da coluna com diferentes valores Rf. Equipamento moderno de HPLC é muitas vezes acoplado a um detector de díodos array (DAD), permitindo que o usuário olhar para o cromatograma resultante de compostos separados em comprimentos de onda de 190 nm a 900 nm. Se os compostos sob investigação são conhecidos, o usuário pode optar por olhar apenas para 1 ou alguns comprimentos de onda selecionados. Por exemplo, a cocaína pode ser observada a 254 nm.
Figura 2: Um típico cromatograma de HPLC
Figura 2: Este cromatograma mostra a separação de compostos a partir de uma reação química, e o cromatograma é visto em 254 nm. Dois picos principais ocorrem em 8,20 e 9 minutos, representando dois compostos com estes tempos de retenção. O número de unidades de absorvância (ua) é indicado no eixo Y, enquanto o tempo de execução é indicado no eixo X.
Aplicações
Dentro da biologia e da medicina, o HPLC é muitas vezes usado como uma ferramenta analítica para ensaio biológico e amostras ambientais para a presença ou ausência de compostos conhecidos (por exemplo metabólitos, drogas, toxinas, agrotóxicos), e pode auxiliar na identificação de desconhecidos compostos.
dentro da química, no entanto, HPLC é rotineiramente usado para monitorar reações químicas, bem como para determinar a pureza dos produtos. Além disso, o processo de HPLC pode ser modificado para HPLC preparativo, em que os compostos de interesse podem ser purificados para posterior utilização.
HPLC pode ser visto como sendo muito complicado para começar, mas tenha certeza, assim como a maioria das outras técnicas de laboratório, faz muito mais sentido quando você realmente faz isso.
fique sintonizado para os meus artigos de acompanhamento nas próximas semanas, em que eu vou passar por algumas dicas sobre como você pode obter o melhor de sua execução HPLC, dependendo do seu objetivo de pesquisa, bem como discutir objetivamente como HPLC pode ser usado dentro de sua pesquisa.
existem outros aspectos desta técnica que você gostaria de ver cobertos em mais detalhes? Se assim for, gostaríamos de ter notícias suas!
Happy HPLC-ing 🙂
isto ajudou-o? Então, por favor, partilhe com a sua rede.escrito por Karen O’Hanlon Cohrt