na década de 1970, a maioria da cromatografia líquida foi realizada utilizando uma fase estacionária de suporte sólido (também chamada coluna) contendo sílica não modificada ou resinas alumina. Este tipo de técnica é agora referido como cromatografia de fase normal. Desde a fase estacionária é hidrofílico nesta técnica, moléculas com propriedades hidrofílicas contidos dentro da fase móvel terá uma alta afinidade para a fase estacionária, e, portanto, absorvem para o empacotamento da coluna. Moléculas hidrofóbicas experimentam menos afinidade para o empacotamento de colunas, e passarão para ser eludidas e detectadas primeiro. A eluição das moléculas hidrofílicas adsorvidas à embalagem de colunas requer a utilização de mais solventes hidrofílicos ou mais polares na fase móvel para deslocar a distribuição das partículas na fase estacionária para a fase móvel. cromatografia de fase reversa é uma técnica que utiliza cadeias Alquil ligadas covalentemente às partículas de fase estacionária, a fim de criar uma fase estacionária hidrofóbica, que tem uma maior afinidade para compostos hidrofóbicos ou menos polares. O uso de uma fase estacionária hidrofóbica é essencialmente o inverso da cromatografia de fase normal, uma vez que a polaridade das fases móvel e estacionária foram invertidas – daí o termo cromatografia de fase reversa. A cromatografia de fase reversa utiliza uma fase móvel polar (aquosa). Como resultado, hidrofóbica moléculas polares fase móvel tendem a adsorver para o nível de fase estacionária, e hidrofílicos moléculas da fase móvel vai passar através da coluna e são eluídas em primeiro lugar. Moléculas hidrofóbicas podem ser eluídas da coluna diminuindo a polaridade da fase móvel usando um solvente orgânico (não polar), que reduz as interações hidrofóbicas. Quanto mais hidrofóbica a molécula, mais fortemente ela se ligará à fase estacionária, e maior a concentração de solvente orgânico que será necessária para eluir a molécula.muitas das considerações matemáticas e experimentais utilizadas em outros métodos cromatográficos também se aplicam à RPC (por exemplo, a resolução de separação depende do comprimento da coluna). Pode ser usado para a separação de uma grande variedade de moléculas. Não é tipicamente usado para a separação de proteínas, porque os solventes orgânicos usados em RPC podem desnaturar muitas proteínas. Por esta razão, a cromatografia em fase normal é mais comumente utilizada para a separação de proteínas. No entanto, a desnaturação das proteínas pode ser benéfica na análise posterior das amostras obtidas a partir da cromatografia. Se for efectuada uma digestão enzimática com tripsina nas proteínas analisadas, a proteína linearizada é mais adequada para este efeito. Assim, a desnaturação de proteínas usando solventes apropriados que causam o desdobramento das proteínas pode ser intencional antes de tomar a amostra fraccionada através da espectrometria de massa.
hoje em dia, a RPC é uma técnica analítica frequentemente utilizada. Há uma variedade de fases estacionárias disponíveis para uso em RPC, permitindo grande flexibilidade no desenvolvimento de métodos de separação.pode ser utilizada para cromatografia de fase reversa qualquer substância polar inerte que produza embalagens suficientes. A coluna mais popular é uma cadeia octadecil de carbono (C18)-sílica colada (classificação USP L1). Segue-se a sílica colada a C8 (L7), a sílica pura (L3), a sílica colada a ciano (L10) e a sílica colada a fenilo (L11). Note que C18, C8 e fenil são resinas de fase reversa dedicadas, enquanto colunas de ciano podem ser usadas em um modo de fase reversa, dependendo das condições de análise e fase móvel. Nem todas as colunas C18 têm propriedades de retenção idênticas. A funcionalização superficial da sílica pode ser realizada em uma reação monomérica ou polimérica com diferentes organossilanos de cadeia curta usados em um segundo passo para cobrir os restantes grupos de silanol (cobertura final). Embora o mecanismo de retenção geral permaneça o mesmo, diferenças sutis nos químicos superficiais de diferentes fases estacionárias levará a mudanças na seletividade.
colunas modernas têm polaridade diferente. PFP é pentafluorfenilo. CN é ciano. NH2 é amino. ODS é octadecil ou C18. ODCN é uma coluna de modo misto constituída por C18 e nitrilo. SCX é uma forte troca catiônica (usada para a separação de aminas orgânicas). O SAX é uma troca aniônica forte (usada para a separação de compostos de ácido carboxílico).