Efeito do colesterol na estrutura de uma bicamada fosfolípida

palavras-chave: simulação molecular comportamento de fase dimiristoilfosfatidilcolina modelo mesoscópico neste artigo abordamos uma questão termodinâmica aparentemente simples: como muda a área por molécula de uma membrana fosfolípida se adicionarmos colesterol? Esta questão foi colocada pela primeira vez por Leathes (1) em 1925 e ainda está sendo discutida hoje. O Significado desta questão está directamente relacionado com a importância do colesterol para o funcionamento das membranas dos eucariontes superiores. Por exemplo, o colesterol regula a fluidez da membrana e modula a função das proteínas da membrana (2). A compreensão destes mecanismos tem motivado muitos pesquisadores a investigar as interações lipid–colesterol em detalhes. Uma vez que uma membrana pode ser vista como um líquido 2D, uma primeira estimativa de como a área por molécula mudaria após a adição de colesterol seria assumir mistura ideal, onde a área por molécula é simplesmente uma média ponderada das áreas de componentes puros. Em 1925, Leathes mostrou que, em vez de mistura ideal, observa-se um comportamento notório não-Visual (1). Este comportamento nonideal é chamado de efeito de condensação (3) porque a área por molécula é muito menor em comparação com a mistura ideal. Porque uma membrana se comporta como um fluido incompressível, uma diminuição da área por molécula irá resultar em um correspondente aumento significativo da espessura total da bicamada. Tal aumento da espessura sinaliza uma reorganização da estrutura da membrana. Uma vez que as alterações na estrutura da membrana podem ter consequências importantes para o funcionamento das proteínas (2), é importante ter uma melhor compreensão molecular das alterações induzidas pelo colesterol.foram propostos modelos conceptuais diferentes para explicar as interacções colesterol–lípidos não-ciais. Exemplos incluem o modelo de complexos condensados (4, 5), o modelo de superlattice (6), e o modelo Guarda-Chuva (7). O modelo de complexos condensados explica o efeito de condensação assumindo que o colesterol induz a formação reversível de um complexo estequiométrico colesterol–lipídico. Em tal complexo a membrana é condensada como as cadeias de acil lipídicas são mais ordenadas. A uma dada concentração de colesterol, existe uma composição de equilíbrio entre estes complexos lipídicos condensados de colesterol e os lípidos comuns. O modelo de superlattice assume que em concentrações críticas as moléculas de colesterol exibem uma ordem específica de longo alcance. O modelo umbrella tem o ponto de vista de que a parte hidrofílica do colesterol é muito pequena e, portanto, os lípidos precisam contribuir para a triagem das moléculas de colesterol a partir de interações hidrofóbicas com água. Os fosfolípidos só podem criar este guarda-chuva se estas moléculas se endireitarem para criar espaço para o colesterol. Nestes modelos, os mecanismos subjacentes à condensação são muito diferentes. Curiosamente, um estudo experimental recente concluiu que seus dados suportavam o modelo dos complexos condensados (8), enquanto outro conjunto de experimentos não encontrou nenhuma indicação dos complexos condensados e suportou o modelo umbrella (9). Estas diferenças nos insights motivaram–nos a desenvolver um modelo mesoscópico de um sistema lipídico–colesterol-água. Usamos simulações moleculares para esclarecer a organização lateral do colesterol nas membranas lipídicas e as interações de colesterol lipídico subjacentes que induzem o efeito de condensação.

várias simulações moleculares de todos os átomos e modelos grosseiros de colesterol em bilayers lipídicos foram relatadas na literatura (para alguns exemplos recentes, Ver ref. 10-13 e suas referências). Idealmente, gostaríamos de usar simulações de todos os átomos para estudar o efeito de condensação em uma grande variedade de temperaturas e composições. Actualmente, porém, estas simulações são demasiado morosas. Portanto, usamos um modelo grosseiro, no qual a eficiência é obtida integrando alguns dos detalhes de um modelo de todos os átomos. Nosso modelo é baseado no modelo de Kranenburg e colegas de trabalho (14, 15). O modelo usa moléculas de água explícitas. Os lípidos e o colesterol consistem em partículas hidrofílicas e hidrofóbicas(ver Fig. 1). Este modelo agrupa grupos de átomos num pseudoatomáceo mesoscópico. As interações intramoleculares incluem vibrações de ligação e flexão de ligação dos quais os parâmetros foram otimizados para imitar a estrutura de uma única molécula de fosfatidilcolina de todos os átomos na água. As interacções hidrofílicas e hidrofóbicas são descritas com interacções soft-repulsivas, e os parâmetros destas interacções estão relacionados com os parâmetros de solubilidade utilizando o método descrito por Groot e Rabone (16). A idéia deste modelo é que as principais forças motrizes da mistura colesterol–fosfolípido são as interações hidrofóbicas e hidrofílicas, que é a conclusão de muitos estudos experimentais (7, 9, 17). No nosso modelo, a unidade de comprimento está diretamente relacionada com o tamanho efetivo de uma pseudoatomáceas, ou seja, uma pseudoatomáceas ocupa um volume de 90 Å3. A unidade de energia resulta da correspondência dos parâmetros de repulsão suave das partículas de água mesoscópicas com a compressibilidade da água em condições ambientes. A simplicidade dos modelos requer uma reparameterização destas repulsões suaves se a temperatura for alterada. No entanto, neste trabalho, assumimos que os parâmetros sejam independentes da temperatura. A escala de temperatura é definida ajustando-se às temperaturas de transição de fase experimental. Mais detalhes e aplicações deste modelo podem ser encontrados em ref. 18.

nosso modelo de colesterol, mostrado na Fig. 1B, baseia-se nos mesmos pressupostos sobre o tamanho efectivo e as interacções que o modelo lipid. Seguindo McMullen et al. (19), fizemos a parte hidrofóbica do modelo de colesterol um pouco mais longa do que a parte hidrofóbica do modelo lipídico, que visa representar dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). Por simplicidade, assumimos que as interações hidrofóbicas e hidrofílicas de uma molécula de colesterol são semelhantes às de um lipídico. Para obter informações sobre o mecanismo molecular do efeito de condensação do colesterol, introduzimos três moléculas semelhantes ao colesterol nas quais perturbamos o equilíbrio hidrofóbico–hidrofílico da molécula: uma em que diminuímos o comprimento da cauda hidrofóbica (ver Fig. 1C), um no qual adicionamos um grupo hidrofóbico adicional (Fig. 1D), e um no qual substituímos o anel por uma corrente simples (Fig. 1E).Fig. 2 mostra o diagrama da fase de composição da temperatura computada do sistema de colesterol–água–fosfolípido. Os limites de fase foram obtidos a partir de uma inspeção visual dos instantâneos e, mais quantitativamente, a partir dos pontos de inflexão das curvas que dão a área por lípido, a espessura hidrofóbica média da membrana, e os parâmetros de ordem da cauda e inclinação. Estas propriedades foram calculadas em função da temperatura e do teor de colesterol.Fig. 2. Diagrama de fase e estrutura das várias fases. Diagrama de fase computadorizada em função da temperatura (em graus centígrados) e da concentração de colesterol. As linhas pretas dão os limites da fase. O código de cores dá o efeito de condensação em um determinado ponto de Estado, onde o azul indica muito pouca condensação e o laranja um grande efeito de condensação. Desenho esquemático das várias fases. La, lípidos na fase líquida; p’β, fase de ondulação; l’β, fase de gel com cadeias lipídicas inclinadas; L ‘C, fase de gel com cadeias lipídicas não inclinadas; Lii, fase de gel, semelhante a L’ C, contendo pequenos aglomerados de colesterol; Lo, fase de ordem líquida. O efeito de condensação é definido como a diferença, em Å2, entre AM, sim e AM, ideal.

vamos primeiro focar nas fases lipídicas puras, e o efeito do colesterol será discutido em seguida. Para o bilayer lipídico puro, o diagrama de fase foi calculado por Kranenburg e Smit (14) para um sistema que é quatro vezes menor. Usamos a mesma metodologia para localizar os limites de fase que Kranenburg e Smit fizeram (14). Os nossos resultados estão em excelente acordo com este estudo, o que indica que os efeitos de tamanho finito são pequenos. Para o fosfolípido puro, observamos a altas temperaturas uma fase líquida (La) na qual as caudas estão desordenadas. A baixas temperaturas, as caudas são ordenadas e inclinadas, o que define a fase gel (L ‘ C). Estas duas fases são separadas pela fase rippled( p’β), na qual observamos uma separação microfásica de domínios em que o bilayer é grosso e os lípidos são ordenados e domínios em que o bilayer é fino e os lípidos desordenados. A presença destas três fases indica que o diagrama de fase resultante está muito bem de acordo com o diagrama experimental do lípido puro (20). A escala de temperatura é definida combinando as temperaturas das transições de fase da fase gel para a fase ondulada (Tp) e a fase ondulada para a fase líquida (Tm) com as correspondentes temperaturas de transição de fase experimental de Dmpc puro. Uma outra comparação com os dados experimentais é feita para a área média por molécula da camada dupla (Fig. 3A), para a espessura da camada intermédia (Fig. 4A), e para a ordem de cauda lipídica (Fig. 4B). Para a área por lípido obtemos 56 Å2 por molécula em comparação com a experimental (21) 60 Å2 por molécula. Para a espessura bilayer calculamos um valor de 38,7 Å, que compara bem com o valor experimental de 36 Å (21), e um acordo semelhante é obtido para a ordem de cauda (ver Fig. 4B). Para calcular a área por molécula para o colesterol puro, simulamos um bilayer de colesterol puro. Obtivemos um valor de 40,3 Å, que se compara muito bem com o valor experimental mais recente de 41 Å (22) para uma monocamadora de colesterol. Considerando as aproximações feitas em nosso modelo, o Acordo entre os valores experimental e simulado é surpreendentemente bom.Fig. 3.

área por molécula em função da concentração de colesterol para as moléculas mostradas no Fig. 1. Dados relativos ao colesterol (a) e às moléculas de colesterol (B) modificadas indicadas na Fig. 1 C–E. (A) comparamos dados experimentais de Hung et al. (21) com os nossos resultados de simulação e as estimativas de mistura ideais. Esta estimativa é dada por AM,mix = (1 − xc)AL + xcAC, com xc como a fracção molar do colesterol. A AL e a AC são a área dos componentes puros por lípido e a área por colesterol, respectivamente. Os dados experimentais e simulações foram ambos A T = 30 ° C. B) efeito das alterações do equilíbrio hidrofóbico–hidrofílico do colesterol; os círculos são para o colesterol em que a parte hidrofílica é aumentada, os quadrados são para o colesterol com uma parte hidrofóbica diminuída, e os triângulos são para o colesterol com uma cauda mais Curta (ver Fig. 1).

vamos agora voltar para o efeito do colesterol nas propriedades da camada intermédia. A primeira questão que vamos abordar é se o nosso modelo pode reproduzir o efeito de condensação. Figo. 3A mostra o efeito do colesterol na área por molécula em função da concentração de colesterol. A comparação com os dados experimentais mostra, mais uma vez, um acordo Muito bom. Nesta figura também mostramos a área por molécula assumindo a mistura ideal. Esta figura ilustra de forma convincente o efeito de condensação; a área por molécula diminui muito mais do que seria de esperar com base na mistura ideal. Outros dados experimentais incluem o efeito do colesterol no inchaço da camada intermédia(Fig. 4A) e o parâmetro “tail order” (Fig. 4B). Tanto os dados experimentais como a simulação mostram que o colesterol aumenta a espessura do bilayer e a sua ordem. Também para estas duas propriedades, nossos resultados de simulação estão em muito bom acordo com os dados experimentais. The simulation and experimental data (Figs. 3A e 4 A E B) mostram que a adição de colesterol modifica fortemente as propriedades da camada lipídica até ±30 mol% de colesterol. Depois disso, uma região é atingida onde a adição adicional de colesterol tem apenas um efeito ligeiro. A 30 mol% de colesterol, tanto a área por molécula e a ordem de cauda lipídica e parâmetros de inclinação têm valores que são típicos para a fase gel.

A codificação de cores na Fig. 2 mostra a diferença entre a área simulada por lípido e o valor estimado assumindo mistura ideal. Observamos que a altas e baixas temperaturas, o efeito de condensação é relativamente pequeno. O efeito de condensação é máximo em uma região bem definida no espaço de fase que está localizado pouco acima da transição de fase principal do fosfolípido puro. Para compreender melhor a natureza do efeito de condensação, é importante compreender o efeito de adicionar colesterol no comportamento de fase da membrana.Fig. 2 mostra as características mais importantes do diagrama de fase. As diferentes fases observadas em nossas simulações também foram observadas experimentalmente, embora nem sempre para a mistura específica de Dmpc e colesterol (20, 23, 24). No entanto, os diferentes estudos experimentais mostram diagramas de fase qualitativamente muito diferentes, o que limita as nossas possibilidades de fazer uma comparação detalhada. Instantâneos das várias fases podem ser encontrados na Fig. 5.Fig. 5. Snapshots of a side view of the bilayer. A) fase La para 10% de colesterol A T = 37 ° C. B) Fase L0 para 40% de colesterol A T = 37 ° C. C) Fase Ripple (p’β) para 5% de colesterol A T = 20 °C. (D) Fase l’β para 5% de colesterol A T = 5 °C. (e) fase L ‘ C para 15% de colesterol A T = 5 °C. (F) Fase LII para 40% de colesterol A T = 5 °C. Os hidrofílicos e as esferas hidrofóbicas dos fosfolípidos são representados em azul escuro e em azul claro, respectivamente. As contas finais das caudas lipídicas são retratadas em cinza. O headgroup de colesterol é representado em amarelo, o anel tetramérico de colesterol e contas de cauda são representados em vermelho. Para maior clareza, não são mostradas contas de água. A diferença na largura dos bilayers ilustra bem o efeito de condensação.

a temperaturas muito elevadas, a adição de até 50 mol% de colesterol tem pouco efeito na estrutura da membrana, e observamos a fase La para todas as concentrações (24). A temperaturas abaixo de Tp, observamos que o colesterol altera a estrutura da fase gel inibindo a inclinação das caudas lipídicas, causando a formação da fase L ‘ C (20) (compare Fig. 5 D com E). Em concentrações mais elevadas de colesterol (>20%), observamos a formação de pequenos aglomerados ricos em colesterol. Nós denotamos esta fase por LII, e esta fase é mostrada na Fig. 5E. a temperaturas entre Tp e Tm, o bilayer puro está na fase ondulatória, e o colesterol transforma esta fase ondulatória (ver Fig. 5C) em uma fase de ordem líquida (23) (Fig. 5B). O termo fase de ordem líquida foi introduzido por Ipsen et al. (25). A espessura da camada intermédia é intermédia entre a espessura do líquido e a fase gel. Os parâmetros de ordem de cauda lipídica têm valores que estão próximos da fase gel; no entanto, ao contrário da fase gel, os lípidos são mais desordenados e não inclinam. O colesterol aumenta gradualmente a temperatura a que ocorre a transição de fase La a Lo. Em concentrações muito elevadas de colesterol, a fase ordenada pelo líquido transforma-se numa fase de gel (LII) quando a temperatura é diminuída abaixo da Tm. Esta fase foi observada experimentalmente para dipalmitoilfosfatidilcolina (26), mas não encontramos dados experimentais para DMPC nestas condições. Voltemos agora ao efeito de condensação. Figo. 2 mostra que o efeito de condensação é máximo a uma temperatura um pouco acima do Tm de transição principal. A razão é que essas condições o puro bicamada é em um líquido-estado desordenado, enquanto que a adição de colesterol para a bicamada de transforma-lo em um líquido-ordenou fase, que tem uma área por lipídio que é muito menor se comparado com o líquido-estado desordenado. Esta grande diferença causa um grande efeito de condensação. A temperaturas mais elevadas, a fase líquida permanece estável para todas as concentrações de colesterol, dando um efeito de condensação muito menor. A temperaturas mais baixas, o bilayer lipídico puro tem uma área por lípido que está muito mais perto da área por lípido da fase ordenada pelo líquido, e como resultado o efeito de condensação é muito menor.os resultados acima indicam que o efeito de condensação é uma consequência direta de alterações particulares no comportamento de fase que o colesterol está induzindo. Na literatura existem várias especulações sobre os aspectos da estrutura de colesterol que são especificamente responsáveis pelo seu efeito de condensação. Por exemplo, o modelo umbrella é baseado na noção de que, em comparação com fosfolípidos, a parte hidrofílica do colesterol é muito menor e precisa do fosfolípido, como guarda-chuva, para triagem adicional a partir de interações com água. Isto sugere que um grupo hidrofílico adicional mudaria completamente as propriedades. Outro fator importante é a estrutura volumosa do anel; se substituirmos o anel por uma cauda, obtemos uma molécula que se assemelha mais a uma molécula de álcool (27). No entanto, encurtar a cauda hidrofóbica teria pouco efeito. Figo. 1 mostra as moléculas de colesterol modificadas que imitam estas alterações. Na verdade, os resultados na Fig. 3B mostram que o encurtamento da cauda do colesterol mostra o mesmo efeito de condensação. No Entanto, Fig. 3B mostra que para ambas as outras modificações da molécula de colesterol, adicionando um grupo hidrofílico adicional e substituindo o anel por uma cadeia linear, nenhum efeito de condensação é observado. Observamos o efeito oposto: adicionar estas moléculas faz com que o bilayer se torne mais expandido em comparação com a mistura ideal. O efeito dos álcoois (menores) na área por molécula foi medido experimentalmente, e os dados experimentais também mostram um aumento (28). Intimamente ligado a isso, observamos que para ambos os casos no diagrama de fase a fase líquida foi estável ao longo de toda a gama de concentração. De fato, observamos que a adição dessas moléculas diminui a temperatura de transição principal, e, portanto, não há região no diagrama de fase onde há um grande efeito de condensação.simulações com estas variações estruturais do colesterol indicam quão surpreendentemente sutil é o mecanismo. A transição principal em um bicamador puro é muito sensível às interações hidrofóbicas. Os headgroups of the lipids screen the hydrophobic tails from the water. A altas temperaturas, a área por lípido é alta, e esta triagem está longe de ser ótima, mas nestas condições a entropia em cadeia domina. Diminuir a temperatura faz com que seja cada vez mais importante visualizar as interações hidrofóbicas e na transição principal eventualmente induz uma ordem das cadeias. Um aspecto fundamental é entender como o colesterol desestabiliza a fase líquida. O colesterol tem uma cabeça hidrofílica menor e é, portanto, menos eficiente em proteger as interações hidrofóbicas. A altas temperaturas, a camada lipídica pode acomodar isso, mas a temperaturas mais baixas os lípidos só podem contribuir para o rastreio do colesterol diminuindo a sua área por lípido. Isto causa a ordenação observada e explica por que a transição principal aumenta. As duas mudanças que introduzimos na estrutura de colesterol influenciam a sua triagem hidrofóbica; em ambas as variantes desaparece a subconselhamento intrínseco do colesterol. Se estas moléculas são adicionadas ao coletor, não há necessidade de triagem adicional das interações hidrofóbicas, e essas moléculas impedem a formação de uma fase ordenada.

vamos comparar nossas observações com os modelos anteriores que foram introduzidos para explicar o efeito de condensação. Em primeiro lugar, nosso modelo não dá nenhuma indicação de ordem de longo alcance como é assumido no modelo de superlattice. Implícito no modelo Guarda-Chuva e nos complexos condensados é a suposição de algum tipo de organização local. Por exemplo, no modelo umbrella assume-se que uma molécula lipídica pode exibir uma ou duas moléculas de colesterol vizinhas (ver por exemplo, ref. 2). Nossas simulações mostram uma estrutura muito mais desordenada na qual não podemos identificar essas estruturas ordenadas. Neste ponto é importante lembrar que nosso modelo contém muitas suposições, o que levanta a questão de saber se as conclusões que tiramos de nossas simulações são relevantes para os sistemas experimentais. Ficamos muito surpresos ao ver que fomos capazes de obter um comportamento de fase tão rico usando um modelo grosseiro que usa forças puramente repulsivas. Nosso modelo dá uma descrição quantitativa muito razoável dos dados experimentais recentes sobre a estrutura do bilayer. O outro aspecto interessante é que nossos cálculos prevêem que o efeito de condensação é máximo em uma faixa de temperatura estreita acima da transição principal. Pode ser possível verificar isso experimentalmente. Um teste muito rigoroso do nosso modelo teria sido uma comparação detalhada com o diagrama de fase experimental. Neste contexto, é encorajador que as fases que encontrámos tenham sido observadas experimentalmente, embora nem sempre para o sistema exactamente simulado. Selecionando cuidadosamente os dados experimentais que concordam com nossas simulações, poderíamos até reivindicar um acordo Muito bom. Uma possível razão para o desacordo entre as várias experiências é que são utilizadas técnicas diferentes, e nem todas as técnicas são igualmente sensíveis às diferenças na estrutura das várias fases. Esperamos que a combinação de um diagrama de fase e informações detalhadas sobre a estrutura das várias fases dê algumas diretrizes sobre se uma determinada técnica experimental pode identificar uma transição de fase particular.