todos os métodos foram realizados de acordo com as directrizes e regulamentos relevantes. Foi obtido consentimento informado de todos os indivíduos.
Material
O seguinte prata curativos foram comparados: Acticoat (Smith&Sobrinho, reino UNIDO; referidas neste artigo como Ac), Aquacel Ag + Extra (Convatec, reino UNIDO; referidas neste artigo como Aq), Silvercel Hidro-Alginato (Systagenix, reino UNIDO; referido neste artigo Como Sc) e Ialugen Plus (IBI, República Checa; referido no presente artigo como Ia).outras substâncias químicas foram obtidas de Sigma-Aldrich (St.Louis, EUA), salvo indicação em contrário.em vários ensaios, foram utilizados extractos de pensos e não os próprios pensos. Estes extractos foram preparados com soro fisiológico (NaCl a 0, 9% (M/v)) ou meios de cultura celular completados com 10% de soro fetal bovino (FBS). A relação entre a área de preparação e a solução foi de 1 cm2 por 4 mL de solução. A extracção foi realizada durante 72 horas na TR com agitação constante. Os extractos foram esterilizados através de um filtro de 0,2 µm e armazenados a 4 °C até à sua utilização.as concentrações de prata nos pensos e nos extractos dos pensos foram medidas utilizando PCI-OES. A concentração de prata foi também avaliada em amostras de pele ex vivo de suínos. 10-70 mg de cada amostra foi transferido para um recipiente PTFE para digestão por microondas. Em seguida, 1 mL de ácido nítrico concentrado (análise de vestígios, Analytika Ltd., República Checa), 0.8 mL de ácido clorídrico concentrado (para análise de vestígios, Analytika Ltd., República Checa) e 0,2 mL de peróxido de hidrogénio (p. a. 30%, Penta Ltd.(República Checa). A amostra foi digerida a 150 ° C durante 5 minutos e depois, na segunda etapa do mesmo ciclo, a 200 °C durante 10 minutos. Após a digestão, a amostra foi transferida quantitativamente utilizando 0,2 mL de peróxido de hidrogénio e água desionizada.
A análise foi realizada com um instrumento ICP-OES (Radial 725, Agilent Technologies, Austrália) equipado com um nebulizador pneumático de pulverização Marinha e câmara de pulverização ciclônica. A quantificação baseou-se na calibração externa. A exactidão e fiabilidade do método foram testadas utilizando amostras de pele de suíno enriquecidas com concentrações conhecidas de Ag a partir de uma solução de referência certificada (Analytika Ltd., checo).análises de microscopia eletrônica de varrimento foram realizadas usando um instrumento Zeiss Ultra Plus (Zeiss, Alemanha). As amostras foram revestidas com uma fina camada de Au/Pd em um quorum SC7620 sputter coater. Imagens foram tiradas por dois InLens secundários e detectores de elétrons SE2 para ampliação maior ou menor, respectivamente. Os parâmetros de varrimento foram os seguintes: tensão de aceleração, 3,5 kV; corrente da sonda, 36 pA; e pressão na câmara, ~ 7 × 10-5 Pa.imagens EDX foram captadas com o instrumento Zeiss Ultra Plus. Mapas e espectros de raios X foram feitos por um detector de raios X-MaxN 80 (Oxford Instruments, Reino Unido). Os parâmetros EDX foram os seguintes: tensão de aceleração, 10 kV; corrente da sonda, 300 pA; distância de trabalho, 8,5 mm; e tempo de processo, 4 .
actividade oxidativa directa dos pensos
a geração de ROS em condições sem células foi avaliada utilizando 3,3′,5,5′-tetrametil-benzidina (TMB) como substrato para a peroxidase de rábano silvestre (HRP). Os círculos de 6 mm de diâmetro foram cortados das guarnições e testados. Resumidamente, a solução de trabalho consistia em TMB 0, 1 mg/mL (solução–mãe c = 1 mg/mL em DMSO) misturada 1:9 com tampão citrato-fosfato de 0, 05 M (pH = 5) e HRP (final c = 0, 16 UI/mL). Cada peça de curativo foi imersa em 0,5 mL da solução de trabalho e colheram-se amostras (25 µL) em 0, 5, 7, 5 e 10 minutos. Imediatamente após a coleta, as amostras foram misturadas na proporção de 1:1 com a 0,16 M H2SO4 e a absorvância foi lida a 450 nm (comprimento de onda de referência = 540 nm), utilizando um NanoDrop OneC instrumento (ThermoFisher Científica, EUA). 30% H2O2 foi utilizado como controlo positivo. Subtraiu-se o sinal de fundo (solução em branco).
penetração de prata na pele des-epitelizada
usámos difusão estática das células de Franz para investigar a penetração de prata na pele des-epitelizada. A pele foi obtida de um matadouro local (Bocus, Letohrad, República Checa) e excisada da parte interna da aurícula suína. O cabelo foi barbeado, a pele foi incubada em PBS (60 °C, 90 s), e a epiderme foi descascada. A espessura média da pele des-epitelizada foi de 2 mm. as peças de pele foram colocadas numa câmara e cobertas com um penso prateado testado ou um pedaço de gaze. Cada câmara doadora foi preenchida com 0, 3 mL de meio de cultura NHDF com 10% de FBS. A câmara de aceitação continha 0,7 mL de meio de cultura. As células de difusão foram incubadas a 37 ° C durante 24 ou 48 horas. Após a incubação, a pele foi lavado com PBS, e as partes da pele que separados o doador e o aceitador câmaras foram analisados para conteúdo de prata usando ICP-OES, como descrito acima. A quantidade de prata que penetrou através da pele des-epitelizada foi medida no fluido doador. Três replicados independentes foram preparados em ambas as vezes.o cultivo de pele ex vivo com pensos frescos (1-2 h) aurículas de suínos (Bocus) foi escrupulosamente limpo com sabão e Betadina (uma solução de PVP-Iodo, Egis Pharma, Hungria) e lavado com água. Os pedaços de pele (1 × 1 cm) dos aurículos foram excisados e colocados em solução antibiótica (solução de penicilina–estreptomicina, 10 000 U/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina) durante 30 minutos a 37 °C Sob O O2 atmosférico e CO2. As amostras de pele com epiderme intacta foram colocadas do lado dérmico para cima, em placas de cultura de 6 alvéolos, com 3 mL de meio NHDF complementado com 10% de FBS, e depois cobertas com 1 × 1 cm de penso prateado seleccionado ou gaze de controlo estéril embebida com 300 µl de meio de cultura. As amostras foram incubadas durante 24 ou 48 horas. Depois, a pele foi lavado com PBS e cada pele explantes foi dividido em terços, para exame histológico (4% PFA fixação a 4 °C), proteína de análise por meio de Western blot (snap congelamento com nitrogênio líquido), e de acordo com pcr (pernoite no RNAlater (Thermo Fisher Scientific), então a − 80 °C).
coloração histológica
a coloração autometalográfica da prata foi adotada de acordo com Danscher et al.49. Imagens foram captadas usando um microscópio Eclipse 50i com uma câmera DS-Fi1 ligada (Nikon, Yokohama-Shi, Japão).
Para a imunofluorescência de yH2AX, os cortes histológicos em Superfrost Mais lâminas de vidro (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foram deparaffinized e incubadas durante a noite com o anticorpo primário (1:1.000, o ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, clone JBW301, Millipore, MA, EUA). Foram então incubados durante 1 h com um anticorpo secundário (ab150114, Abcam, Cambridge, Reino Unido; diluição 1:10 000) e montados em lâminas com um Antifade de diamante prolongado com DAPI (ThermoFisher Scientific). Imagens foram captadas com um microscópio fluorescente Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japão).
expressão genética
pele de suíno após incubação com pensos foi processada para isolamento de ARN, síntese de cDNA e expressão do gene qPCR, como descrito anteriormente por Klein et al.50 TaqMan de PCR em Tempo Real Ensaios (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) utilizados de acordo com pcr foram: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Os valores-limite do ciclo foram normalizados para o gene de arrumação RPL13A e relacionados com amostras de controlo de gaze para o tempo específico (intervalo 24 – ou 48-h) utilizando o método 2−Δδct51. Foram medidas e calculadas, em média, seis amostras independentes para cada tratamento e tempo. A significância das diferenças na expressão genética em relação ao controle de gaze foi avaliada usando o teste t do estudante para cada curativo de prata no tempo especificado.
Western blotting
para a análise subsequente da Mancha ocidental, os lisatos de tecidos foram preparados a partir de pele de suíno congelada. Utilizar um bisturi numa gota de tampão de lise (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0, 5% de desoxicolato de sódio; 1% de sulfato de dodecilo de sódio; 4% de uréia), a pele foi cortada em pequenos pedaços, que foram posteriormente homogeneizado em 350 µl do tampão de lise usando uma caixa de aço inoxidável de 5 mm de esferas e um homogeneizador de tecidos (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Alemanha) por 10 min a 25 Hz. A concentração de proteínas foi medida através do kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific).as proteínas dos lisados foram separadas usando uma SDS-PAGE de gradiente de 4-15% e transferidas para membranas de Difluoreto de polivinilideno. Para detectar proteínas específicas, as membranas foram incubadas durante a noite num tampão de bloqueio (Tris 20 mM; NaCl 137 mM; 0,05% Tween 20; 5% de leite em pó magro e seco) com o anticorpo primário fosfo-histone H2A. X (20E3) (1:1.000; Sinalização Celular, EUA). a β-actina foi utilizada como controlo da quantidade de proteínas (1:2000; Santa Cruz, EUA). As membranas foram desenvolvidas com Ig anti-coelho conjugado com HRP ou anti-rato utilizando detecção quimioluminescente para visualizar sinais (substrato Clarity Western ECL; Bio-Rad, EUA). Os sinais foram digitalizados e avaliados com uma aliança 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVItec Limited, Reino Unido).
actividade antibacteriana
o método de difusão à ágar foi utilizado para comparar as actividades antimicrobianas dos pensos. Incubou-se uma amostra (1 cm2) de cada penso numa placa de Petri recentemente inoculada com Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa; estas estirpes foram isoladas de feridas crónicas humanas, caracterizadas e cultivadas como descrito anteriormente52. Além disso, a eficácia antimicrobiana dos extractos de penso (preparados em meio RPMI com 10% de FBS, como acima descrito) foi comparada através do método de microdilução53. A densidade óptica foi medida por um Leitor multimodo de Mira (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) a 600 nm para 24 h (agitação, 37 °C).
cultura de células
fibroblastos dérmicos humanos normais da pele adulta (NHDF) foram comprados a Lonza (Basileia, Suíça). NHDF foram cultivadas em Dulbecco modificado Águias baixa de glicose no medium (DMEM) suplementado com 10% FBS, glutamina (0,3 mg/mL), glicose (4 mg/mL), penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (0,1 mg/mL) em 75 cm2 cultura frascos em 5% de CO2 e a 37 °C até a quinta passagem. Os queratinócitos HaCaT foram comprados a Hölzel Diagnostika (Köln, Alemanha) e foram cultivados da mesma forma, mas sem a adição de glicose ao meio.
A Medição da viabilidade
cinco mil células por alvéolo foram semeadas numa placa de 96 alvéolos com 200 µL de meio de cultura com 10% de FBS numa incubadora (37 °C, 5% de CO2) durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com 200 µL de uma diluição em série de extratos de curativos (100%, 50%, 20%, ou 10% do extrato diluído em meio de cultura suplementado com 10% de FBS) por 24, 48 e 72 h. As células de controlo foram tratadas com um meio de cultura padrão de 10% de FBS. A viabilidade foi medida como descrito anteriormente 54 utilizando o ensaio de brometo de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT). A solução-mãe MTT (20 µL; C = 5 mg/mL) foi adicionada ao meio de cultura celular em cada alvéolo. As placas foram incubadas durante 2,5 h a 37 ° C. Depois, a solução de MTT foi removida, foram adicionados 220 µL de solução de lise (1:1 propan-2-ol com DMSO, 10% (w/v) Triton X-100 e 0,37% (w/v) HCl), e a lise foi realizada durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo (150 rpm). A absorvância foi lida a 570 nm e 690 nm com um leitor de placas de visionamento multimodo (PerkinElmer, EUA). Os dados foram processados em Kaleido (PerkinElmer, EUA). A absorvância final foi calculada como A = A570 – A690. A alteração da viabilidade das células tratadas em relação às células de controlo foi calculada como Alteração = (uma amostra/um controlo – 1) × 100.as células
foram semeadas numa densidade de 300 000 células por alvéolo numa placa de 6 alvéolos e incubadas no meio de cultura, completadas com 10% de FBS a 37 ° C e com menos de 5% de CO2 até se obter a confluência. Os pensos foram cortados em quadrados de 1 cm2, colocados na camada celular, e incubados com o meio de cultura padrão para 6 h. as células de controle foram tratadas apenas com o meio. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS e fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 minutos. As células foram manchadas com solução de 0,1% (P/v) de violeta cristal (dissolvida em etanol a 10%) durante uma hora e depois lavadas com água. As zonas de inibição foram fotografadas utilizando uma câmara digital Digital Canon EOS 80D EF-S 18-55 mm f (Canon).
coloração fluorescente de células
para análise de danos ao ADN, as células NHDF foram semeadas em lâminas microscópicas numa placa de 6 alvéolos com uma densidade 2 × 105 por alvéolo e autorizadas a aderir durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com extratos de curativo diluídos de 5 × e incubadas durante 24 h. subsequentemente, as células foram fixadas utilizando 4% de PFA durante 15 minutos. Após permeabilização e bloqueio, As lâminas foram incubadas com um anticorpo primário anti-yH2AX rabbit (sinalizador Celular, EUA; diluição de 1:500 num tampão de bloqueio—20% FBS, 0,3 M glicina, 0,05% Tween 20 em PBS; durante a noite; 4 °C). A detecção foi efectuada utilizando um anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 555 (Abcam, Reino Unido; 1:500 num tampão de bloqueio; 1 h, RT). Os diapositivos foram montados utilizando um Antifade de diamante prolongado com DAPI (ThermoFisher Scientific). Após as lâminas serem secas, as imagens foram tiradas usando um microscópio fluorescente Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japão).o stress oxidativo intracelular foi detectado utilizando uma sonda DCF-DA, que é sensível à concentração global de ROS no interior das células. As células foram semeadas durante a noite numa placa de 24 alvéolos e depois rotuladas com DCF-DA (1 µg/mL) durante 15 minutos, após o que foram tratadas com extratos diluídos de 5 × e incubadas a 37 °C e com menos de 5% de CO2. 5 mM H2O2 foi usado como um controle positivo. A fluorescência verde do DCF foi registada a cada 15 minutos durante um período de incubação de 90 minutos, utilizando um microscópio automatizado S3 Incucito (Bioscience Essen, EUA). A quantificação da fluorescência intracelular foi realizada no Software Fiji de acordo com o método descrito por Čepa55.um comité de ética independente aprovou a colheita de amostras de sangue para o teste de rutura por oxidação de neutrófilos e o teste MAT (Ethical Committee for Research at Masaryk University, Brno, Czechia, approval no. EKV-2018-083). Todos os doadores deram o seu consentimento por escrito.
a ruptura oxidativa (produção de ROS) dos fagócitos sanguíneos foi determinada no sangue total diluído por quimioluminescência aumentada pelo luminol (CL) utilizando um luminómetro microplate LM-01T (Immunotech, República Checa). Resumidamente, a mistura de reacção consistiu em 6 µL de sangue total em 54 µl de meio de crescimento RPMI-1640 misturado com 60 µl de extracto de penso em solução salina fisiológica ou num meio suplementado com FBS. Esta mistura foi incubada a 37 ° C durante 20 minutos. Pouco antes do início da medição, adicionámos luminol de 1 mM (uma solução-mãe de 10 mM de luminol num tampão de borato de 0,2 M) (sondas moleculares, EUA). Determinámos a produção espontânea de ROS e ROS induzida por partículas de zimosano opsonizadas (OZP—0, 1 mg / mL) (Sigma-Aldrich, EUA) ou 12-miristato de phorbol 13-acetato (PMA-0, 8 µM); Sigma-Aldrich, EUA). As amostras não tratadas sem os extractos testados foram avaliadas como controlos. Os testes foram executados em duplicados. A quimioluminescência foi registada continuamente durante 90 minutos a 37 ° C e foi expressa em unidades de luz relativa (Ulu). Determinamos a quantidade total de produção de ROS a partir da área integrada sob a curva de quimioluminescência.o teste de activação dos monócitos (MAT)
MAT foi realizado em 10 × heparinização do sangue total humano diluído com solução salina. Foram recolhidas amostras de sangue de cinco dadores saudáveis, agrupadas e diluídas com solução salina. As amostras de sangue diluído foram incubadas com círculos de 6 mm de diâmetro cortados a partir de pensos em microtubos esterilizados durante 24 h a 37 °C. paralelamente, lipopolissacarídeo (LPS, final c = 0. 25 UI / mL; e-Toxato padrão de endotoxina; Sigma, US) foi adicionado à segunda série de amostras incubadas com amostras de curativo para estimular uma resposta imunitária inata às bactérias. Células sanguíneas sedimentadas durante a incubação, deixando uma fase superior do plasma diluído em solução salina. Após a Incubação, foram recolhidos 200 µL de cada amostra de plasma diluído em solução salina e imediatamente acondicionados em duplicados para o IL-6, utilizando um Kit ELISA humano não revestido, de acordo com o protocolo do fabricante (ThermoFisher Scientific, EUA). A absorvância foi lida usando um leitor de placas multimodo EnSight (PerkinElmer, EUA) e a concentração final IL-6 foi calculada por Kaleido SW (Perkin Elmer, EUA). Os restantes plasma e células sedimentadas foram armazenados a 4 °C para a avaliação da hemólise e toxicidade.hemólise foi detectada no plasma restante diluído em solução salina e nas células sedimentadas do tapete. Após centrifugação, 100 µL de cada amostra foi transferido para uma microplaca de 96 alvéolos e a absorvância foi medida a 550 nm. Triton X-100 a 1% foi utilizado como controlo positivo.
libertação de LDH
as toxicidades dos pensos de prata para as células sanguíneas foram avaliadas através de um ensaio de lactato desidrogenase (LDH) (detecção de Citotoxicidade KitPLUS, Roche, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Foram utilizadas duas fontes de células sanguíneas-o sangue humano inteiro incubado com pensos de prata como no tapete, e neutrófilos isolados. A absorvância utilizada para a correcção do fundo foi medida em amostras em branco sem o reagente LDH. Os resultados são comunicados como valores absolutos de densidade óptica em comparação com uma amostra não tratada.
análise estatística
salvo indicação em contrário, o teste-t do Estudante foi utilizado para avaliar a significância estatística das diferenças entre as amostras e os controlos não tratados.