Introduction
Kcat is the turnover number — the number of substrate molecule each enzyme site converts to product per unit time. Se você conhece a concentração de locais de enzimas, você pode encaixar o Kcat em vez de Vmax ao analisar uma curva substrato versus velocidade.
modelo
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X é a concentração de substrato.
Y é a velocidade enzimática.kcat é o número de rotatividade, o número de vezes que cada local enzimático converte substrato em produto por unidade de tempo. Isto é expresso no inverso das unidades de tempo do eixo Y. Por exemplo, se Y está em micromoles de substrato por minuto, então kcat é o número de moléculas de substrato produzidas por local catalítico por minuto.
Km é a constante de Michaelis-Menten, nas mesmas unidades que X. É a concentração de substrato necessária para atingir uma velocidade enzimática semi-máxima.
Et é a concentração de sítios catalíticos enzimáticos. Se a enzima tem subunidades múltiplas, note-se que Et é a concentração de sítios catalíticos, que podem ser maiores do que a concentração de moléculas enzimáticas. Os valores em Y que introduzem são a velocidade enzimática introduzida em unidades de concentração por tempo. O Et deve ser inserido nessas mesmas unidades de concentração (enquanto as unidades de tempo são definidas pelo kcat).
Vmax é a velocidade máxima da enzima nas mesmas unidades que Y. não é diretamente mostrada no modelo acima. É a velocidade da enzima extrapolada para concentrações muito elevadas de substrato, por isso é quase sempre maior do que qualquer velocidade medida no seu experimento. É calculado multiplicando Et vezes kcat.
relação com o modelo Michaelis-Menten
a curva mostrada acima é idêntica à curva definida pelo modelo Michaelis-Menten. Você terá curvas idênticas quando você ajustar qualquer modelo aos seus dados, e valores idênticos para Km. o modelo Michaelis-Menten encontra o Vmax, que é a velocidade máxima da enzima extrapolada para concentrações muito elevadas de substrato. É expresso nas mesmas unidades que usou para introduzir os seus valores em Y (actividade enzimática). Normalmente é fácil expressar isto (ou converter para ) moles / minuto / mg de proteína. O Vmax é determinado pelo número de locais enzimáticos presentes (Et) e pela velocidade a que a enzima pode converter substrato em produto (kcat). se souber a concentração de locais enzimáticos que adicionou ao ensaio (Et), pode ajustar a constante catalítica do Kcat utilizando o modelo acima.
ao calcular o Kcat, as unidades de concentração cancelam, de modo que o Kcat é expresso em unidades de tempo inverso. É o número de rotatividade — o número de moléculas de substrato que cada local enzimático converte em produto por unidade de tempo.
encaixar o modelo com Prism
1.Crie uma tabela de dados XY. Introduza a concentração do substrato em X e a velocidade da enzima em Y. Se tiver várias condições experimentais, coloque a primeira na coluna A, a segunda na coluna B, etc. Você também pode escolher os dados da amostra de Prism: cinética enzimática — Michaelis-Menten.
2.Depois de introduzir os dados, clique em analisar, escolha regressão não linear, escolha o painel de equações cinéticas enzimáticas e escolha o Kcat.
3.Você deve restringir Et a um valor constante, baseado em outras experiências. Para restringir o valor de Et, vá para a página de restrição da janela de regressão não linear, certifique-se que a queda ao lado de Et é definida como “constante igual a” e indique o valor. Para os dados da amostra, indicar 100 como o valor de Et.
Se você não sabe o valor de Et, você não pode caber o kcat, mas em vez disso deve caber o Vmax. Não é possível que Prism se encaixe tanto no kcat quanto no Et, uma vez que os dois parâmetros estão entrelaçados, e uma curva de Velocidade do substrato não dá nenhuma informação sobre seus valores individuais.
4.Com os dados da amostra, Prism relata que Km= 5.886 com um intervalo de confiança de 95% variando de 3.933 a 7.839. O melhor valor de ajuste do kcat é 13.53, com um intervalo de confiança de 95% variando de 11.97 a 15.09.
Notes
•See the list of assumptions of all analyses of enzyme kinetics.
•esta equação se encaixa exatamente na mesma curva que a equação que se encaixa Vmax, ao invés do número de rotatividade Kcat. O produto do Kcat times Et (a concentração de locais enzimáticos) é igual ao Vmax.
•esta equação está relacionada com a equação para enzimas alostéricas. Que o modelo alostérico adiciona um parâmetro adicional: o declive da Colina h. Quando h é igual a 1,0, os dois modelos são idênticos.