existe frequentemente muita confusão sobre o Significado de “unidades enzimáticas”, “actividade enzimática” e “actividade enzimática específica”. Este guia explica estes conceitos-chave em termos simples e discute a concepção do doseamento enzimático e a importância de operar na “gama linear”. Nós também consideramos curvas padrão e se você deve plotar concentração ou quantidade absoluta de produto no eixo x. Algumas dicas sobre a configuração de controles de doseamento e subtrair espaços em branco são discutidas. Finalmente, explicamos como os valores da atividade enzimática são calculados e damos uma visão geral simples das equações cinéticas.
definições de Unidades enzimáticas
enzimologia seria menos complicado se todos usassem a mesma definição de unidade. Uma definição padrão da unidade é dada abaixo:
1 unidade (U) é a quantidade de enzima que catalisa a reacção de 1 umol de substrato por minuto (definição a).
na maioria das configurações de R&D, 1 umol de substrato é realmente um monte de material e outras definições podem ser preferidas para evitar expressar quantidades em frações de unidades. A seguinte definição não-padrão é comumente utilizada:
1 unidade (U) é a quantidade de enzima que catalisa a reação de 1 nmol de substrato por minuto (definição B).
Note que a alteração na definição tem um efeito profundo no número de unidades indicado, ou seja, 1 unidade de enzima de acordo com a definição A equivaleria a 1000 unidades de acordo com a definição B!
pode também ver as unidades enzimáticas expressas como unidade Mili (ou mU) o que significa simplesmente um milésimo de uma unidade, independentemente de como a unidade foi definida.
claramente a quantidade real de uma enzima num tubo não é alterada simplesmente alterando a definição da unidade, mas é necessário cuidado ao comparar as actividades de amostras de diferentes fornecedores. Desde que as definições de unidade sejam fornecidas, você pode transformar o número indicado de unidades em nmol por min, o que é inequívoco e permite comparações válidas.
Para maior clareza em seu próprio trabalho, você pode preferir usar ‘nmol por min’ (ou ‘umol por min’), embora se constante repetição é necessária, então, claramente, a muito curto prazo “unidade” tem suas atrações.o que é “actividade enzimática”
a actividade é citada em unidades por ml (U/ml), por outras palavras nmol por min por ml (se tiver sido adoptada a definição da unidade B). Assim, os valores da actividade expressos em unidades estão também sujeitos a um “aumento” ilusório de 1000 vezes se se passar da definição da unidade A Para A definição da unidade B. Também não pode haver confusão se a actividade for expressa em nmol por minuto por ml e não em unidades por ml.uma vez que a actividade se relaciona com a concentração, dois frascos para injectáveis de enzima podem conter o mesmo número de unidades (no total), mas têm actividades diferentes (concentrações).qual é a actividade enzimática específica?a actividade enzimática específica (geralmente declarada simplesmente como “actividade específica”) é o número de unidades enzimáticas por ml dividido pela concentração de proteínas em mg/ml. Por conseguinte, os valores específicos da actividade são indicados como unidades/mg ou nmol/min/mg (se for aplicada a definição da unidade B).a actividade específica de
é uma medida importante da pureza enzimática e os valores para diferentes lotes de uma enzima pura devem ser os mesmos, dentro de um erro experimental normal.as diluições em série de
de uma solução enzimática terão valores de actividade enzimática diferentes, mas valores específicos de actividade idênticos, uma vez que, no cálculo da actividade específica, o numerador (unidades/ml) e o denominador (mg/ml) são igualmente afectados pela diluição da amostra.embora a actividade específica seja muito diferente da actividade, o cálculo da actividade específica, no entanto, depende do valor da actividade, pelo que o valor da actividade específica indicada também será dependente da definição da unidade enzimática. Os lotes abaixo do valor de actividade específica esperado podem conter impurezas ou moléculas enzimáticas que se tornaram desnaturadas.nesta secção discutimos por que razão uma enzima pode ter diferentes valores de actividade medidos em diferentes laboratórios. Com isso queremos dizer diferenças reais na atividade medida, não diferenças aparentes causadas pelo uso de diferentes definições de unidade.as condições em que é efectuado um doseamento influenciarão os valores de actividade notificados. Por exemplo, os ensaios normalmente são realizados a uma temperatura entre 20-37°C. em Geral, uma enzima vai ser mais ativo em 37°C do que a 20°C.
A definição da enzima unidade seria melhor expressa assim:
1 unidade (U) é a quantidade de enzima que catalisa a reação de 1 nmol de substrato por minuto em condições normais.
Infelizmente, o termo ‘condições padrão’ está aberto à interpretação e pode haver diferentes preferências do usuário, pelo menos em R&D ambientes. Assim, dez laboratórios de pesquisa diferentes podem (muito corretamente) calcular diferentes atividades para a mesma solução de enzima. A maioria dos laboratórios de pesquisa estabelece suas próprias “condições padrão” e verificar cada novo lote internamente. Em configurações clínicas, as “condições padrão” são explicitamente definidas e todos os laboratórios são obrigados a realizar testes idênticos.o valor da actividade (unidades/ml) para a sua enzima é o parâmetro mais importante quando está a desenvolver um ensaio. Isto porque o volume (ou seja, o número de unidades) que você adiciona irá determinar a quantidade de substrato que é convertido em produto. Lembre-se, 1 unidade catalisa a conversão de 1 nmol de substrato por min (definição B).
As unidades/ml notificadas podem dar-lhe uma ideia aproximada da quantidade de enzima a adicionar, mas como o valor da actividade pode não ter sido determinado num teste idêntico ao seu, é habitual preparar diluições em série da enzima (por exemplo, inicialmente diluições de log) e testar um volume fixo de cada diluição. Dependendo do sinal do ensaio (que estará relacionado com a quantidade de substrato convertida), pode ser necessário um segundo ensaio para se obter uma diluição adequada.qual é exactamente a melhor diluição? Para responder a isso, precisamos pensar sobre o aspecto mais importante do design do ensaio – intervalo linear. É importante que o trabalho quantitativo opere numa gama em que um gráfico do sinal do doseamento (muitas vezes absorvância) versus a concentração enzimática seja linear. A maioria dos ensaios é linear se o grau de conversão do substrato for inferior a 15%, assumindo-se que não existem outros factores limitativos. Fixando o tempo de ensaio (por exemplo, 30 minutos) e a temperatura (por exemplo, 25oC), o grau de conversão pode ser controlado simplesmente ajustando um parâmetro, ou seja, o número de unidades enzimáticas adicionadas.
isto é ilustrado graficamente na Figura 1 com diluições expressas como recíprocas (isto é, diluição de 1/10 = 0,1 no eixo dos x). O seu próprio lote pode diferir na sua forma e gama linear, mas a uma concentração enzimática muito elevada, sem dúvida, o sinal do ensaio não aumentará proporcionalmente à quantidade de enzima adicionada.
O ensaio na Figura 1 é linear até à densidade óptica (OD) 2.5 e um factor de diluição de 0, 02 (diluição 1/50 de enzima) seria ideal para o trabalho do ensaio, uma vez que dá um sinal grande (~1,5) e se encontra no meio da Gama linear. Cálculos baseados em resultados para os fatores de diluição no intervalo entre 0.04 0.12 (i.e. a região com redução de inclinação) irá subestimar o verdadeiro nível de atividade da enzima porque algo está claramente limitar a magnitude do sinal de ensaio.muitos factores podem funcionar para limitar o intervalo linear e o intervalo varia de ensaio para ensaio. Uma razão comum para a não linearidade é o consumo excessivo de substrato, que pode causar a queda da taxa de reação, mas as limitações dos componentes ópticos do leitor de placas (ou qualquer dispositivo de medição utilizado) também podem ser significativas. A maioria dos leitores de placas, por exemplo, não pode medir de forma fiável valores de absorvância superiores a 3 e esta limitação aplicar-se-á independentemente da percentagem do substrato que foi convertido em produto.
Fig 1. Absorvância Versus quantidade de enzima
embora não discutido de outra forma neste guia, deve-se também estar ciente de que as enzimas podem desnaturar ao longo do tempo, especialmente se forem muito diluídas, e os produtos de algumas reacções podem inibir a enzima. Na verdade, existem outras razões possíveis para um comportamento não linear, mas é geralmente relativamente fácil encontrar o intervalo linear por tentativa e erro usando diluições seriais da enzima, como descrito acima.estes parâmetros podem também influenciar a gama linear, uma vez que afectam a taxa de conversão do substrato. Por exemplo, um doseamento pode ser linear após 15 minutos, mas a 60 minutos pode ter sido consumido demasiado substrato. Nesta situação, teria de reduzir a quantidade de enzima para executar o ensaio durante 60 minutos. Aplicam-se as mesmas considerações à temperatura do ensaio, uma vez que também pode afectar a taxa de reacção.
A maioria das pessoas adota um tempo de teste de algum lugar entre 15 minutos e 60 minutos. Devem ser evitados tempos muito curtos (por exemplo, 2 minutos), uma vez que um ligeiro atraso na paragem da reacção conduzirá a um erro significativo nos cálculos da actividade. É importante assegurar que os reagentes armazenados num frigorífico ou congelador se equilibram com a temperatura correcta antes da utilização, o que é especialmente importante se tiver um tempo de ensaio relativamente curto.do ponto de vista prático, o volume do ensaio é determinado/limitado pelo produto consumível que utiliza para os seus ensaios (por exemplo, cuvetas, tubos ou microplates). O sinal para a maioria dos ensaios enzimáticos é proporcional ao volume do ensaio e as tentativas de miniaturizar o ensaio (por exemplo, para conservar reagentes) conduzem normalmente a sinais mais baixos. No entanto, os ensaios de absorvância são muitas vezes uma exceção, e uma mudança de uma cuveta de 3ml para uma micro-cuveta de 1ml, por exemplo, não vai mudar a leitura de absorvância se a largura (comprimento do caminho) da cuveta ainda é de 1 cm (i.e. a luz ainda passa pelo mesmo “comprimento” do líquido). Isto porque a absorvância é proporcional ao comprimento do caminho, não ao volume da amostra.em ensaios de absorvância em microplacas, o comprimento do percurso é igual à profundidade do líquido e é possível miniaturizar sem perda de sinal reduzindo o diâmetro dos poços e mantendo uma profundidade constante de líquido. Por exemplo, placas de 96 poços pode facilmente acomodar 200ul de amostra, mas com um 50ul ensaio de volume seria melhor usar um de 384 poços da placa para aumentar o comprimento do caminho mais que visto com 50ul de amostra em uma placa de 96 poços.A maior parte dos ensaios é efectuada durante um período fixo (ensaios de ponto final) e a reacção é interrompida pela adição de um reagente de paragem (por exemplo, ácido). No entanto, em ensaios contínuos a aparência do produto (menos comumente o consumo de substrato) é registrada continuamente (por exemplo, o uso de substrato). por meio de um gravador gráfico). As mesmas regras básicas se aplicam; um gráfico de sinal versus tempo para uma quantidade fixa de enzima deve ser linear e a taxa deve duplicar se a quantidade de enzima for duplicada. Enquanto o ensaio estiver a ser efectuado na gama linear, a actividade de “desconhecidos” devidamente diluídos pode ser determinada com precisão a partir das taxas de reacção iniciais medidas com um conjunto de normas.que concentração do substrato devo utilizar?
a concentração do substrato irá influenciar a taxa de reacção, mas existem vários factores a considerar na selecção da concentração “correcta”. Do ponto de vista prático, uma consideração fundamental é a quantidade de produto que deve ser gerada para dar um sinal de ensaio mensurável. Uma vez que é provável que a taxa de reacção enzimática diminua quando mais de 15% do substrato foi hidrolisado, a concentração inicial do substrato deve ser, em geral, de pelo menos 10% da concentração do produto que se sabe dar um sinal de doseamento aceitável.outra consideração é O Km para o substrato. Embora adicionando mais substrato geralmente significa que você verá valores de atividade mais elevados, a relação não é linear e o custo do substrato pode precisar ser considerado. Neste ponto é provavelmente útil introduzir a equação clássica de Michaelis-Menten:
v = (Vmax S)/(Km + s) ……………. Eqn. (1)
em que v é a taxa, Vmax é a taxa máxima possível, S é a concentração do substrato e Km é igual à concentração do substrato que dá metade da actividade máxima. A derivação desta equação e seus pressupostos subjacentes pode ser encontrada em qualquer livro de texto sobre cinética enzimática. Embora seja normal medir em vez de calcular a taxa de reacções enzimáticas, é útil compreender os princípios subjacentes para efeitos de concepção do ensaio.a equação de Michaelis-Menten é útil na medida em que ajuda a selecionar uma concentração adequada de substrato se o Km for conhecido.
Quando S = Km, v = (Vmax s)/2S, ou seja, v/Vmax = S / 2S = ½.por outras palavras, a enzima funcionará a 50% da sua taxa máxima possível quando S=Km.
substituindo na equação 1 Os valores de S = 10 E Km = 1 verá que, ao aumentar a concentração do substrato 10 vezes a enzima actua agora a cerca de 90% da sua taxa máxima possível, em vez de 50%. Claramente isto é mais alto, mas não 10 vezes mais alto.
a concentrações muito elevadas de substrato, o Km na equação 1 numericamente torna-se insignificante e a taxa medida é então igual a Vmax.muitos ensaios são realizados com a concentração do substrato no valor de Km ou em torno dele, mas se o Km for muito alto, pode não ser possível utilizar uma concentração tão elevada de substrato (por exemplo: por razões de custo ou de solubilidade limitada).em algumas situações, pode mesmo ser aconselhável utilizar uma concentração de substrato relativamente baixa. Por exemplo, na descoberta de medicamentos farmacêuticos, o uso de concentrações muito elevadas de substratos tornaria mais difícil identificar inibidores enzimáticos competitivos (os inibidores competitivos ligam-se ao mesmo local que o substrato).
é necessário encontrar um equilíbrio entre os vários factores de modo a que o ensaio tenha um sinal mensurável, possa funcionar na gama linear e possa cumprir quaisquer outros objectivos do ensaio (por exemplo, custo, tempo, etc.).curvas padrão
curvas padrão
é sempre necessária uma curva padrão se desejar calcular a actividade enzimática. Não é essencial se você só está interessado em valores de atividade relativa.a curva-padrão é construída medindo o sinal de ensaio com soluções-padrão do produto de reacção numa gama adequada de concentrações. Idealmente você deve executar uma curva padrão para cada experiência, mas se a curva padrão é altamente reprodutível, pode ser aceitável executá-la periodicamente.
uma curva padrão típica é mostrada na Figura 2 abaixo. Trata-se de uma curva padrão para um ensaio ATPase, na qual o ATP é hidrolisado em ADP e Pi (fosfato inorgânico).
Fig. 2. Curva-padrão para Pi
O fosfato é detectado através de um reagente ligante que muda de cor na presença de fosfato. Contudo, as especificidades deste ensaio não são importantes neste caso; seja qual for a natureza do produto ou o método de detecção utilizado, deve ser construída uma curva normalizada que mostre a dependência do sinal em relação à quantidade de produto no ensaio. A “curva” (idealmente uma recta) é utilizada para determinar a quantidade de produto gerada em amostras com actividade desconhecida, ou seja, a partir do valor de absorvância, lendo a ordenada na origem no eixo dos X. (A maioria dos pacotes gráficos de software irá calcular automaticamente os valores de x a partir dos valores medidos de y). A quantidade de actividade pode então ser calculada (ver mais adiante).I plotar a concentração ou a quantidade absoluta no eixo dos X?
não há uma única resposta correta aqui, e a possibilidade de usar qualquer uma das abordagens pode muitas vezes causar confusão quando os valores de atividade são calculados. Por exemplo, plotar nmol do produto no eixo x é muito conveniente se você precisar calcular os valores de atividade (lembre-se, atividade = nmol por min por ml). No entanto, reagentes de laboratório são geralmente preparados em concentrações conhecidas, e muitas vezes é mais fácil traçar estes valores no eixo x. No entanto, ao calcular a actividade (ou actividade específica) da sua enzima, deve lembrar-se de converter a concentração no eixo dos x no número de nmóis do produto formado, o que significa que deve ter em conta o volume do ensaio. A razão é fácil de entender: Os volumes 50ul e 100ul de uma solução-padrão terão a mesma concentração, mas o volume maior conterá o dobro da quantidade de produto. Geralmente, é melhor escolher uma abordagem (ou seja, traçar a quantidade absoluta do produto ou a concentração) de modo a que o mesmo método de cálculo da actividade seja sempre utilizado.
controlos e subtracção de dados em branco
controlos adequados são de importância vital para o trabalho quantitativo, assim como a utilização correcta dos dados de controlo nos cálculos.os controlos de
indicam-lhe (indirectamente) a quantidade do sinal do ensaio devido à acção da enzima e a quantidade que surge por outras razões. Uma fonte comum de sinal “falso” é o substrato (que muitas vezes pode estar contaminado com o produto). Outros componentes do ensaio podem também dar origem a um pequeno sinal, dependendo da natureza dos componentes e do tipo de ensaio. O objetivo dos controles é permitir que você remova (por subtração) quaisquer elementos do sinal total que não estão relacionados com a ação da enzima. Se o ensaio for bem concebido e os reagentes do ensaio forem de boa qualidade, o tratamento dos controlos é geralmente bastante simples.algumas diretrizes gerais são dadas abaixo: se retornarmos ao ensaio colorimétrico para detecção de fosfato inorgânico podemos destacar alguns problemas potenciais que são prontamente detectados com controles apropriados.
o reagente de detecção de fosfato dá uma leitura baixa de cerca de 0.08 numa placa de 96 alvéolos no comprimento de onda utilizado para a medição (cerca de 650nm).
Podemos definir os seguintes ensaios/controles (leituras, entre parênteses, em uma hipotética ensaio situação):
- ensaio Todos os componentes menos enzima (0.5)
- Enzima sobre ele próprio (0.1)
- Enzima além de todos os outros componentes (1.8)
Claramente o sinal de ensaio de 1.8 não é unicamente devido a ação da enzima sobre o substrato.
para qualquer doseamento enzimático, um controlo-chave (A) consiste em Excluir a enzima (e substituir por tampão). Isto dar-lhe-á o sinal de fundo para todos os outros componentes do doseamento como grupo, incluindo o substrato que pode conter uma pequena quantidade de produto. Este controle não lhe diz O sinal de fundo para a enzima, mas claramente você não pode adicionar a enzima ao substrato como um controle! Na maioria dos ensaios, a enzima não emite qualquer sinal porque é diluída significativamente antes de ser utilizada no ensaio. Isto pode ser facilmente verificado, como em B acima.os dados da amostra a (acima) sugerem que a mistura está contaminada com fosfato inorgânico. Os componentes individuais podem então ser verificados para identificar a fonte do problema. Esta situação é bastante comum em ensaios de ATPases e outras enzimas produtoras de fosfato, uma vez que os substratos são frequentemente instáveis e são parcialmente hidrolisados para dar algum fosfato inorgânico.
pode ser estranho corrigir dados brutos se vários componentes dão sinais falsos; a eliminação do problema na fonte é geralmente muito melhor do que qualquer tratamento matemático. O valor “corrigido” para a amostra C acima pode parecer 1.2 (i.e. 1.8 – 0.5 – 0.1) mas estritamente falando isso é errado. Lembre-se da placa de ensaio mais reagente de detecção dar um sinal de fundo de cerca de 0,08, de modo que a fonte da maior parte do sinal para o controle A é o plástico da placa e/ou o reagente de detecção. O mesmo pequeno sinal também deve ser escondido dentro do valor para o controle enzimático. Assim, na correção aplicada acima, subtraímos este Branco oculto duas vezes.
terá sempre de subtrair os controlos dos dados do ensaio, sendo preferível combinar todas as substâncias (excepto as enzimas) e subtrair um único valor. Se esta abordagem for adoptada, a curva-padrão é tratada da mesma forma e subtrai-se um valor de controlo (ou seja, o valor obtido na ausência de produto, ou seja, análogo ao branco placa/reagente acima referido). Assim, nem os dados do ensaio subtraídos nem a curva-padrão subtraída contêm o sinal de fundo potencialmente enganador causado pelo reagente placa/ensaio.
finalmente, como vimos, sinais falsos são facilmente detectados com controles apropriados, mas a melhor estratégia para obter dados de boa qualidade é usar reagentes com fundos baixos de modo que os valores de controle são baixos. Também é útil gerar um sinal de ensaio (devido à enzima) que é muito maior do que qualquer sinal de fundo. Idealmente, a relação sinal-fundo deve ser de, pelo menos, 5 e, de preferência, 10 ou mais para um trabalho quantitativo preciso.isto é bastante fácil de compreender se voltarmos a calcular os dados do ensaio bruto de forma gradual. Por exemplo, digamos que geramos 10nmol de produto em nossa reação enzimática (isto é, determinado a partir da curva padrão de sinal versus quantidade absoluta de produto). Uma vez que a actividade é expressa em nmol por min por ml, temos de considerar o tempo e o volume e, talvez menos obviamente, a quantidade e diluição da enzima para calcular a actividade.se o ensaio tiver 10 min de comprimento, o número de nmol por min no exemplo acima é 1. (step1)
Se o volume do ensaio for 200ul, temos de multiplicar por 5 (ou seja, 1000/200) para obter nmol por min por ml. (Passo 2)
Este valor está relacionado com a actividade da enzima no doseamento, não na amostra de enzima utilizada para estabelecer o doseamento. Alguns outros fatores de correção são necessários para determinar a atividade enzimática na amostra original da enzima.
a enzima pode ter sido diluída antes da utilização e tem de ser posteriormente diluída pelos outros componentes presentes no ensaio. Se o ensaio (200ul no total) inclui 20 ul de enzima, e a enzima é pré-diluído 1/100 antes de 20 ul de amostra é adicionada, você provavelmente pode ver que devemos multiplicar o primeiro por 10 (passo 3) e, em seguida, por 100 (passo 4), para se obter a atividade da enzima no original solução enzimática.até agora, isto é relativamente simples. No entanto, mencionamos anteriormente que a concentração é muitas vezes plotada no eixo x da curva padrão. Assim, os valores podem ser expressos em termos mM (não mmol) e você não pode determinar o número de mmol simplesmente inspecionando a curva padrão.uma vez que mM significa mmoles por litro, temos uma discrepância entre o volume implícito de 1L e o volume real do ensaio. Assim, se tivermos um produto de 10 mm e o volume do ensaio for 200ul, precisamos dividir por 5000 para obter o número de mmoles do produto.
pode notar aqui que dividir por 5000 aqui compensa algumas das operações de multiplicação que eram necessárias acima. Com efeito, é perfeitamente normal que os factores de correcção sejam anulados. Por exemplo, num ensaio de 10 minutos utilizando uma enzima diluída de 1/10, dividir-se-á por 10 para obter nmol por min e multiplicar-se-á por 10 mais tarde para corrigir o factor de diluição.segue-se que se utilizar sempre as condições padrão do doseamento (i.e. seu padrão), você será capaz de multiplicar o valor ‘ x ‘ da curva padrão por um único fator de correção global, que engloba todos os outros fatores de correção individuais, para calcular seus valores de atividade. Só na primeira ocasião é necessário identificar os factores de correcção individuais.
inibição enzimática / rastreio de fármacos
esta é uma área de enzimologia onde permanece a necessidade de operar no intervalo linear, mas onde os cálculos dos valores da actividade não são normalmente relevantes; em vez disso, a taxa relativa de reacção (ou a quantidade relativa de produto formado) na presença e ausência de uma substância em estudo é fundamental, o que requer pouco mais do que cálculos simples utilizando os dados do ensaio em branco. Após a subtracção dos ensaios em branco, a quantidade de produto formado é expressa em percentagem da quantidade obtida na ausência da substância em estudo (ou seja, 100%). Estes ensaios podem, por vezes, ser efectuados com uma relação sinal-fundo bastante baixa, porque a questão que se coloca é se a substância em estudo inibe a reacção.
– requer apenas uma resposta sim / não.
resumo
Esperemos que este guia tenha fornecido explicações claras sobre as “unidades enzimáticas”, “actividade enzimática” e “actividade enzimática específica”, bem como sobre as definições das unidades e a importância da “Gama linear”. As especificidades do que traçar no eixo x das curvas padrão é uma questão de preferência do usuário, mas algum cuidado é necessário quando as atividades são calculadas. Os controles doseamento são importantes, mas usar reagentes de alta qualidade é melhor do que remover fundos usando abordagens matemáticas. É desejável uma elevada relação sinal / fundo para o trabalho quantitativo e uma série de parâmetros podem ser variados para aumentar o sinal do ensaio; nem sempre é necessário simplesmente adicionar mais enzima. Os valores da actividade enzimática podem ser calculados facilmente se for utilizada uma abordagem gradual para identificar as principais variáveis do ensaio.
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