cromatografia líquida de Alta eficiência a espectrometria de massa é uma extemely versátil técnica instrumental, cujas raízes encontram-se na aplicação das mais tradicionais de cromatografia líquida de teorias e de instrumentação que foram originalmente desenvolvidos para a cromatografia gasosa (GC). Como o nome sugere, a instrumentação inclui um cromatógrafo líquido de alta resolução (HPLC) ligado, através de uma interface adequada, a um espectrómetro de massa (MS). A principal vantagem que o HPLC/MS tem sobre o GC/MS é que ele é capaz de analisar uma gama muito mais ampla de componentes. Os compostos que são termicamente láteis, apresentam elevada polaridade ou têm uma massa molecular elevada podem ser todos analisados utilizando HPLC/MS, mesmo as proteínas podem ser analisadas rotineiramente. As soluções derivadas de amostras relevantes são injectadas numa coluna de HPLC que compreende um tubo de aço inoxidável estreito (normalmente com 150 mm de comprimento e 2 mm de diâmetro interno, ou menor), embalado com partículas de sílica finas e quimicamente modificadas. Os compostos são separados com base na sua interacção relativa com o revestimento químico destas partículas (fase estacionária) e com a eluição do solvente através da coluna (fase móvel). Os componentes eluídos da coluna cromatográfica são então introduzidos no espectrómetro de massa através de uma interface especializada. As duas interfaces mais comuns utilizadas para HPLC/MS são a ionização por electrospray e as interfaces de ionização química por pressão atmosférica.
ionização por Electrospray
na ionização por electrospray o analito é introduzido na fonte a taxas de fluxo tipicamente da ordem de 1µl min-1. O fluxo da solução de analito passa através da agulha de electrospray que tem uma grande diferença potencial (em relação ao eletrodo do contador) aplicada a ela (tipicamente na faixa de 2,5 a 4 kV). Isto força a pulverização de gotículas carregadas da agulha com uma carga de superfície da mesma polaridade à carga sobre a agulha. As gotículas são afastadas da agulha para o cone de recolha de amostras no eléctrodo do contador (apresentado em azul). À medida que as gotículas atravessam o espaço entre a ponta da agulha e o cone, ocorre a evaporação do solvente. Isto está assinalado no Figo.1 e ampliada em Figo.2. À medida que a evaporação do solvente ocorre, a gota encolhe até atingir o ponto em que a tensão superficial não pode mais sustentar a carga (o limite de Rayleigh) no ponto em que ocorre uma “explosão Coulombiana” e a gota é dilacerada. Isto produz gotículas menores que podem repetir o processo, bem como moléculas de analito carregadas nuas. Estas moléculas de analito carregadas (não são estritamente íons) podem ser carregadas isoladamente ou multiplicar-se. Trata-se de um método muito suave de ionização, uma vez que o analito retém muito pouca energia residual aquando da ionização. É a geração de moléculas carregadas multiplicadas que permite a análise de componentes de peso molecular elevado, tais como proteínas, uma vez que a gama de massa do espectrómetro de massa é grandemente aumentada, uma vez que na verdade mede a razão massa / carga em vez da massa em si. A principal desvantagem da técnica é que muito pouca (geralmente nenhuma) fragmentação é produzida, embora isso pode ser superado através do uso de técnicas de espectrometria de massa tandem, tais como MS/MS ou MSn.
Figura 1 Um esquema de uma interface ESI
Figura 2 esquemática do mecanismo de iões de formação
pressão Atmosférica ionização química
ionização química a pressão Atmosférica (APCI) é um análogo método de ionização a ionização química (CI). A diferença significativa é que a APCI ocorre à pressão atmosférica e tem suas aplicações primárias nas áreas de ionização de compostos de baixa massa (a APCI não é adequada para a análise de compostos lábeis termicamente). A configuração geral da fonte (ver Fig. 3) compartilha uma forte semelhança com ESI. Quando a APCI difere da ESI, está na forma como ocorre a ionização. Na ESI, a ionização é comprada através da diferença potencial entre a agulha de pulverização e o cone, juntamente com a dessolivação rápida mas suave. Na APCI, a solução de analito é introduzida em um nebulizador pneumático e desolvida em um tubo de quartzo aquecido antes de interagir com a descarga de corona criando íons. A descarga de corona substitui o filamento de elétrons em CI – a pressão atmosférica rapidamente “queimaria” quaisquer filamentos-e produz N2+ e N4°+ primários por ionização eletrônica. Estes íons primários colidem com as moléculas de solvente vaporizado para formar íons de gás reagentes secundários – por exemplo, H3O+ e (H2O)nH+ (ver Fig. 4). Estes íons de gás reagentes então passam por colisões repetidas com o analito resultando na formação de íons de analito. A alta frequência das colisões resulta numa elevada eficiência de ionização e Termalização dos iões do analito. This results in spectra of predominantly molecular species and adduct ions with very little fragmentation. Uma vez que os íons são formados, eles entram no estágio de bombeamento e focalização em muito o mesmo que ESI.
Figura 3 esquemática dos componentes de um APCI fonte
Figura 4 Uma visão mais detalhada do mecanismo de APCI
Diagramas e texto (parcial) pelo Dr. Paulo Portas, Escola de Química, Universidade de Bristol