o advento da biologia aeróbica foi anunciado cerca de dois bilhões de anos atrás, quando cianobactérias primitivas evoluíram a capacidade de fotooxidizar a água. O oxigênio foi liberado como um produto de desperdício, e os níveis atmosféricos de O2 aumentaram rapidamente. Esta rápida mudança para uma atmosfera oxigenica introduziu um poluente devastador, mas eventualmente os organismos evoluíram que capitalizaram sobre a força motriz forte para a redução de O2. Locais ativos enzimáticos que eram capazes de ligar e ativar o oxigênio evoluíram, e novas classes de bioquímica que usam O2 como um dissipador termodinâmico para conduzir reações desfavoráveis se tornaram possíveis. A eficiência do metabolismo alimentar mudou drasticamente. A quantidade de ATP que pode ser produzida por metabolização aeróbica de glicose, por exemplo, aumentou quase 20 vezes. Eucariontes apareceram pouco depois da atmosfera oxigenica e foram eventualmente seguidos pela diversidade de organismos multicelulares que existem hoje. Em nossa bioquímica aeróbica, O2 é usado em uma infinidade de reações sintéticas que são fundamentais para quase todos os aspectos do crescimento celular, desenvolvimento e reprodução.
apesar da sua versatilidade bioquímica, no entanto,>95% do oxigénio que consumimos é usado na respiração. Elétrons de alta energia derivados de alimentos atravessam a cadeia de transporte de elétrons mitocondriais em uma série de reações redox exergônicas. Estas transferências de elétrons de descida energética são usadas para desenvolver o gradiente de prótons quimiossosmótico que, em última análise, produz ATP. O oxigênio é o último aceitador de elétrons nesta cascata respiratória, e sua redução à água é usada como um veículo para limpar a cadeia mitocondrial de elétrons gastos e de baixa energia. A enzima que catalisa este processo, a citocromo oxidase, cobre a membrana mitocondrial. Liga-se, activa-se e reduz-se até 250 moléculas de O2 por segundo e associa a energia libertada neste processo à translocação de protões que contribuem para o gradiente quimiosmótico. O mecanismo pelo qual a citocromo oxidase catalisa esta química notável tem sido estudado intensamente. Os resultados relatados nesta edição por Fabian, Wong, Gennis e Palmer fornecem uma nova visão sobre este processo e suportam a crescente noção de que conceitos unificadores existem para a forma em que enzimas utilizadoras de oxigênio ativam O2 para clivagem e redução de o⩵o bond (1).
a redução de O2 na citocromo oxidase ocorre sob restrições graves. O processo ocorre com pouco excesso de potência, a liberação de intermediários de oxigênio parcialmente reduzidos e tóxicos do local ativo é minimizada, e a energia livre disponível na redução de O2 é associada com alta eficiência à translocação de prótons (2, 3). A enzima opera sob estas restrições usando um heme Fe, chamado heme a3, e um íon de cobre, chamado CuB, em um centro binuclear no qual O2 se liga e é reduzido (ver Fig. Figo.1).1). A entrada de elétrons para este local ocorre a partir do citocromo c por meio de um segundo ferro heme, heme a, e um segundo centro de cobre, CuA. Recentemente, o grupo de Yoshikawa (4) e o grupo de Michel (5), independentemente e simultaneamente, forneceram estruturas cristalinas da enzima que deram uma visão profunda de muitos aspectos do ciclo catalítico, particularmente como prótons e oxigênio são susceptíveis de se mover através da proteína. O mecanismo de redução de O2 pela oxidase tem sido perseguido por um número de grupos com uma variedade de técnicas espectroscópicas (para revisões, ver refs. 6 e 7). A partir deste trabalho, uma sequência de reação simplificada que envolve intermediários transitórios, mas detectáveis, no centro binuclear pode ser escrita como segue(ver também Fig. Figo.2):2):
A P a F e das espécies, em particular, chamaram a atenção, como eles têm sido implicados no mecanismo de bombagem que as unidades de translocação de prótons (8). O trabalho recente de Michel (9) e de Wikström e colegas de trabalho (10) destacou tanto o progresso quanto as incertezas na nossa compreensão do mecanismo que os casais transferem elétrons exergônicos para oxigênio com movimento de prótons endergônico através da membrana.
o centro binuclear na citocromo oxidase. Heme a3 e CuB são mostrados junto com o ligando proximal para o ferro heme, H376, e o ligando CuB, H240, que é cruzado com Y244 (24, 25). A ligação e redução de O2 ocorre na região entre o ferro a3 e a CuB.
um esquema simplificado para a reacção entre citocromo oxidase e O2. O local binuclear, que contém heme a3, CuB, e a estrutura de ligação cruzada H240-Y244 (H – Y), é mostrado. A redução e protonação da forma oxidada do centro produz o local reduzido. Isto liga O2 para formar inicialmente a espécie oxi, que reage ainda mais para produzir intermediários P E F, antes de regenerar a forma oxidada da enzima. A redução de P E F é limitada por reacções de transferência de protões, conforme indicado. Os passos entre P e a forma reduzida do local foram implicados em processos de bombeamento de protões, que são indicados por setas vermelhas. A estequiometria destes passos é uma questão de investigação atual, embora até quatro prótons possam ser bombeados durante o ciclo completo.
uma questão contínua para desvendar a química do oxigénio no centro binuclear da citocromo oxidase e a sua ligação à Bomba de protões é estabelecer as estruturas moleculares dos intermediários no esquema acima. Existe consenso de que o intermediário F envolve um intermediário ferryl-oxo em heme a3, a34+⩵O (3, 6, 11, 12), mas a estrutura de P tem sido uma questão de considerável controvérsia. As atribuições iniciais desta espécie postularam que ela continha uma ligação intacta, A33+—O2⩵ espécies, daí sua designação como P para “peroxi” (e.g., refs. 3, 8 e 13). Weng e Baker, no entanto, interpretaram seus dados ópticos para indicar que o⩵o bond clivage já tinha ocorrido em P e que esta espécie, também, tinha uma estrutura A34+⩵o no centro binuclear (14). Esta conclusão foi subsequentemente apoiada por várias investigações espectroscópicas (15-17). Kitagawa, Proshlyakov e seus colegas de trabalho conseguiram usar espectroscopia Raman para detectar o movimento de alongamento a34+⩵o (18,19) em uma forma de P gerado pela adição de peróxido à enzima oxidada. Trabalhos posteriores mostraram que a mesma vibração poderia ser observada quando o oxigênio é adicionado a uma forma reduzida de dois elétrons da enzima, confirmando que a química do oxigênio e do peróxido na oxidase procede através de intermediários comuns (20). Além disso, o curso temporal do aparecimento de P neste trabalho mostrou que esta espécie é cineticamente competente (ver também ref. 21 e 22). Assim, a partir do trabalho espectroscópico, e do trabalho computacional recente também (23), a visão emergente é que P é realmente uma espécie o⩵o bond-clived.o trabalho relatado por Fabian et al. (1) fornece provas novas, independentes e convincentes de que a ligação O⩵O é clivada na citocromo oxidase ao nível P. Em seus experimentos, eles argumentaram que nem átomo de oxigênio em uma estrutura peroxídica de ligação intacta é provável a troca com água solvente. Se P ocorre como a espécie a34+⩵o, no entanto, então se espera que o segundo átomo de oxigênio é provavelmente ao nível de hidróxido ou água e que este oxigênio pode bem trocar com água no tampão aquoso. Usando 18O2 como substrato em um tampão aquoso que continha H216O, eles aprisionaram o p intermediário e afiançaram para a aparência de H218O. Seus resultados espectrométricos de massa mostram claramente que um único átomo de oxigênio do substrato 18O2 é permutável com água de solvente, em excelente acordo com sua análise acima e a atribuição de P como uma espécie de ferril-oxo clivada.
a realização de que P tem uma estrutura a34+⩵o tem uma série de implicações importantes. A transformação de O2 ligado na espécie oxi em hidróxido (ou água) e um ferril-oxo em P requer um total de quatro elétrons. Apenas três, no entanto, estão prontamente disponíveis no centro binuclear-dois de heme a3 como ele vai de +2 para o estado de Valência +4 e um de CuB como ele é oxidado de cuproso para Cuprico. A fonte do quarto elétron não é clara. A oxidação do macrociclo heme, como ocorre em compostos I em algumas peroxidases, pode ser eliminada com base em dados de Raman e ópticos (6, 7), e Cu3+ não foi detectado em meio biológico. O candidato mais provável, então, é uma cadeia lateral de proteína redox-ativa, como ocorre no citocromo c peroxidase, no qual triptofano é redox ativo, ou na prostaglandina sintase, que contém um resíduo oxidável de tirosina (24). Yoshikawa e colegas de trabalho (25) forneceram evidências cristalográficas marcantes que apoiam fortemente a ocorrência de uma cadeia lateral redox ativa. Eles mostraram que o Y244 no centro binuclear está cruzado com um dos ligantes da cria, H240, e que o grupo cabeça de fenol é orientado de modo que o grupo −OH aponta diretamente para a cavidade de ligação O2 (Fig. (Figo.1).1). Michel relatou dados cristalográficos semelhantes (26), e Buse e colegas de trabalho relataram recentemente dados bioquímicos que suportam a ocorrência da ligação cruzada H240-Y244 (27). Foram também notificados dados EPR recentes que indicam a presença de radicais tirosil quando o peróxido é adicionado à enzima de repouso, embora a(s) Cadeia (s) lateral (s) específica (s) envolvida (s) não tenha (m) sido identificada (s) (28, 29). Em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a tirosina reticulada é a fonte do quarto elétron na ativação e redução do O2 pela citocromo oxidase. Esta conjectura leva ao ciclo de reação simplificado na Fig. Figo.2,2, em que a estrutura reticulada H-Y é mostrada explicitamente e proposta para ser oxidada ao radical neutro tirosil no intermediário P.
O regime na Fig. Figo.22 destaca as analogias entre a citocromo oxidase e as peroxidases e catalases em termos de clivagem química de ligação oxigénio–oxigénio e em termos dos produtos que resultam da reacção. In oxidase, the enzyme extracts three electrons from metals in the active site and a fourth electron from an organic moiity to reduce O2 in one step to O⩵ and OH—. Ambos os produtos estão ao nível da água, embora protonação e liberação posteriores só ocorrem em etapas posteriores da reação. Em peroxidases e catalases, a enzima extrai um elétron de um metal no local ativo e um segundo elétron de uma fracção orgânica para reduzir H2O2 em um passo para o⩵ e OH—. Em peroxidases e catalases, o produto imediato desta química é o composto I, que contém uma espécie de ferrilo-oxo e um radical orgânico. Estas estruturas são exatamente análogas à estrutura A34+. o/radical que ocorre em P na citocromo oxidase. O radical orgânico no composto I é reduzido em um passo subsequente nas enzimas peroxidase e catalase para produzir o composto II, que mantém a estrutura ferryl-oxo. Em oxidase, a mesma química ocorre para produzir o intermediário F. A similaridade em química das proteínas heme metabolizadoras de oxigênio só surgiu com a realização da estrutura a34+⩵o para P e sugere que outras enzimas metabolizadoras de oxigênio podem seguir o mesmo tipo de química na ativação e redução de oxigênio e peróxidos.uma estratégia interessante emerge da Fig. Figo.22 em termos de como a oxidase associa química de oxigénio à Bomba de protões. Os passos de bombeamento só ocorrem após a formação de P (8-10), o que significa que a enzima activa e reduz o O2 a moléculas de água do produto totalmente reduzidas mas incompletamente protonadas; a enzima completa a transferência de elétrons de quatro elétrons para oxigênio, e armazena a energia livre que resulta em alta oxidação de A34+⩵O e espécies radicais, antes de iniciar a bomba. Cálculos recentes sobre a química de ligação-clivagem sustentam esta ideia, como os resultados indicam que a redução de O2 para oxo e hidroxo com a formação de um radical e um ferryl-oxo está perto do termoneutral (23). Isso representa uma estratégia notavelmente eficaz para evitar espécies tóxicas, parcialmente reduzidas de oxigênio, como nenhuma ocorre no ciclo de reação. Além disso, ao transferir a energia livre que será usada para conduzir a bomba de produtos de oxigênio subestacionados para a proteína, parece que a oxidase maximizou o controle e eficiência com que pode operar o aparelho de translocação de prótons.