Durante a translocação etapa da fase de alongamento da síntese de proteínas, o mRNA é avançada por um codão, juntamente com o movimento da tRNAs do ribossomal Um (aminoacyl) para P (peptidyl) e P a E (exit) locais, em um processo catalisado por fator de alongamento EF-G (1). Em primeiro lugar, os tRNAs movem-se na subunidade dos anos 50 para os Estados híbridos P/E E A/P, seguido pelo movimento dos loops de caule anticodon tRNA (ASLs) dos 30 subunidades A E P para os locais P E E, Respectivamente, acoplados ao movimento dos codões de mRNA associados (2). O primeiro passo é acompanhado por rotação intersubunit (3-7), enquanto o segundo passo requer EF-G·GTP, e envolve rotação do domínio de cabeça subunidade 30S (8-11). Embora muito tenha sido recentemente aprendido sobre a base estrutural do Movimento P-tRNA para o site E(9, 10, 12, 13), Os intermediários de translocação que contêm a-tRNA são mais difíceis de capturar. Assim, muito do nosso pensamento sobre a base estrutural de Um-tRNA e do mRNA do movimento foi baseado em estruturas cristalinas do EF-G vinculado ao vago (14) ou P-tRNA-contendo ribossomo complexos preso em clássica (15) ou híbrido estados (10, 12, 13) e dois cryo-EM estruturas de 70 ribossomo-EF-G complexos contendo dois tRNAs dependente de P/E e A/P* híbrido estados (16), ou em ap/P e pe/E quimérica, híbrido estados (11). aqui relatamos a estrutura cristalina de um intermediário de translocação ribossoma 70 contendo EF-G, mRNA, e dois tRNAs – a desacilados no estado pe/E E e um peptidil-tRNA preso em um estado chimérico AP/ap. O complexo foi formado com T. thermophilus 70 ribossomas, um mRNA de 39 nucleótidos, elongator tRNAMet no local P E N-acetyl-Val-tRNAVal no local A. Para encurralar o intermediário de translocação, adicionamos neomicina para bloquear a conclusão da translocação, e ácido fusídico para evitar a libertação de EF-G (métodos suplementares; Fig. S1). A estrutura foi resolvida usando dados de difração para 3.8 Å obtidos a partir de um único cristal (tabela S1). Exemplos de densidade de elétrons são mostrados em materiais suplementares (figos. S2-S13). Em relação ao ribossomo de Estado clássico (17), a cabeça de subunidade dos anos 30 sofre uma grande rotação anti-horário de 21°, e o corpo de 30 ° sofre uma rotação de 2,7° em relação à subunidade dos anos 50 (Fig. 1, Fig. 2A, B). O ciclo-tronco do anticodonte P-tRNA (ASL) move-se com a cabeça dos 30 para uma posição entre o local P da cabeça dos 30 e o local E do corpo dos 30 (pe estado quimérico).; Fig. 1D, E), enquanto o seu fim aceitador se move completamente para o local 50S e (Fig. 1C), formando um estado híbrido PE/e chimeric (9-11). O a-tRNA ASL move-se para dentro de ~4Å dos elementos p-site do corpo dos 30 (Fig. 1D); seu cotovelo gira em direção ao local clássico 50S P, mas sua extremidade aceitadora está ligada entre as subunidades 50S A E P (Fig. 1C), formando um estado chimérico ap/ap. A grande rotação dependente de EF-G da cabeça dos 30 na nossa estrutura reposições helix H38 de 23S rRNA, permitindo que o cotovelo a-tRNA alcance a posição do cotovelo tRNA do p-site (Fig. S14). O domínio IV da EF-G está preso no local de convergência do local a mRNA codon, o laço anticodon da AP / ap tRNA, e 16S e 23S rRNAs na intersubunit bridge B2a, simultaneamente contactando todas as quatro RNAs(Fig. S15).
(A) ribossomo 70S com tRNAs vinculado clássica, a Um/A e P/P de estados (17); (B) Translocação intermediário complexo, mostrando tRNAs preso na intermediária quimérica híbrido ap/pa e pe/E estados. C) Comparação das posições do ARNr nos Estados clássicos e no intermediário de translocação, alinhadas com a subunidade dos anos 50; D) posições relativas das ls tRNA, alinhadas com o corpo da subunidade dos anos 30 ou com a cabeça da subunidade dos 30. Componentes moleculares são de cor todo como: 16S rRNA, ciano; 30S proteínas, azul; 23S rRNA, cinza; 5S rRNA, azul-claro; 50 proteínas, magenta; mRNA, verde; Um/A e ap/ap tRNAs, amarelo; P/P e pe/E tRNAs, vermelho; EF-G, cor de laranja.
(A–B) posições de tRNAs na (a) ribossoma de Estado clássico e (B) intermediação de translocação. (C-D) Interactions of the tRNA ASLs and mRNA as they move from the (C) A and P classical states to the (D) ap and pe chimeric hybrid states. (E-F) rearranjo do laço 966 (h31) de 16S rRNA na subunidade 30S da sua (e) posição clássica de ligação p-tRNA para (F) forma um bolso de encaixe de superfície em torno da ap/ap tRNA ASL.
embora a rotação da cabeça dos 30 facilite claramente a translocação ASL do local P (9-11), a ASL do local A é translocada por um mecanismo diferente. O ASL de P-site move-se precisamente com 30 rotação de cabeça para o estado pe/E, enquanto o ASL de a-site moveu-se mais do que o movimento rotacional da cabeça para o estado ap na subunidade 30 (Fig. 1E). Movimento de Um local ASL-se precisamente com a rotação da cabeça resultaria em grave confronto com o domínio IV do EF-G, como é posicionado no nosso complexo, que, juntamente com o contato formado entre a ponta do domínio IV e o codão-anticodon hélice do ap/ap tRNA (Fig S16), sugere que o movimento de mRNA e ASL são acoplados ao de domínio IV. O adicional de deslocamento da ap/ap ASL leva-o perto de pe/E ASL (Fig. 2C, D) (11). A posição da cabeça pode ser estabilizada pela interacção entre o fosfato 1210 de 16S rRNA com o domínio IV de EF-G No Gly531.
Mais impressionante é o rearranjo do ciclo 16S rRNA 966 na cabeça dos 30 anos, que se rompe do site P para chegar ao local A, onde inicia contato com o parcialmente translocado ap / ap-ASL(Fig. 2E, F). Este rearranjo envolve o rompimento da embalagem do m22G966 contra a ribose 34 do P-site ASL (18, 19), e a formação de uma superfície de ajuste de bolso em torno do ap/ap-ASL por nucleotídeos A965, m22G966 e C1400. Numa estrutura cristalina do complexo de tRNA único correspondente (10) (Fig. S6), o pe/e tRNA ASL foi encontrado para manter todos os contatos canônicos de P-site com a cabeça de 30, incluindo o laço 966, enquanto ele gira em direção ao site E. No entanto, no complexo two-tRNA relatado aqui, apenas um subconjunto das interações da cabeça do site P-30S com o pe/e ASL são mantidos, envolvendo G1338, A1339, a1340, e a cauda C-terminal da proteína uS9. A formação de interações pós-translocação simultaneamente com a interrupção de interações pré-translocação, sugere um mecanismo para como as ssa são entregues entre os locais A E P. Pode também representar uma mudança inicial nos contactos que deve ser interrompida para libertar o pe/e tRNA ASL antes da rotação de 30 cabeças nas fases finais de translocação (20, 21).
a rede de interacções formadas entre o loop 1 conservado (resíduos 499-504) no domínio IV da EF-G, A ASL ap/ap e o seu códon mRNA (Fig. S15) (11) são semelhantes aos observados no estado pós-translocação (15), sugerindo que são mantidos ao longo do ciclo de translocação. Sua semelhança com o menor-groove interações feitas por A1492 e A1493 com o codão-anticodon hélice na decodificação site (22) sugerem que eles podem ajudar a manter a correta codões anticodon emparelhamento durante o movimento entre a e P de sites (15), e são consistentes com a proposta de que a EF-G facilita a translocação através da desestabilização medicamentosas em 30 de decodificação site (23).foram propostas interacções entre o ARNm e os elementos da cabeça dos 30 dentro do túnel de entrada do ARNm a jusante para levar o ARNm para a frente com o ARNm durante a rotação da cabeça (17). No entanto, não é claro que o movimento líquido do ARNm poderia ser sustentado desta forma, porque estas interações são interrompidas durante a rotação da cabeça. Descobrimos que a cauda estendida do ARNm, à medida que emerge do túnel a jusante, curva-se para cima para se ligar à superfície da proteína uS3 na cabeça da subunidade (Fig. 3, S17). Assim, a rotação da cabeça para a frente moveria ativamente o ARNm na direção da translocação. A comparação da posição de um nucleótido de referência no ARNm nos Estados rotacionados e não rotacionados mostra ainda que a rotação da cabeça para a frente faria avançar o ARNm por um codon (Fig. 3D), apoiando a possibilidade de que o ARNm seja ativamente movido pelo ribossomo durante a translocação. Uma vez que as dimensões do túnel a jusante excluem a entrada de uma hélice de ARN, a ruptura da estrutura secundária de mRNA pela ribosomal helicase (24) deve ocorrer na ou perto da entrada do túnel, por interacção com o ribossoma fora do túnel. A ligação da cauda do mRNA imediatamente flanqueando a entrada do túnel exclusivamente para a cabeça dos anos 30 proporciona tal interação. As forças criadas pela rotação da cabeça poderiam assim desestabilizar o emparelhamento de base em elementos helicoidais do mRNA à medida que entram no túnel a jusante.
(a) a entrada no túnel de entrada do mRNA a jusante está rodeada de proteínas uS3, uS4 e uS5. Posições + 14 a + 21 entram em contacto com um sistema transdérmico carregado positivamente na superfície da proteína uS3 na cabeça dos 30 (Fig. S17). B) trajectória do ARNm a jusante e C) ângulo de rotação de 90°. (D) a acoplagem no Corpo 30 da estrutura clássica (17) (cinzento) mostra que a rotação da cabeça na estrutura intermédia ap/ap traduz o ARNm por um codão. A-codon (amarelo) e P-codon (vermelho).
No clássico do estado, C74 e C75 na CCA cauda de P-site tRNA formulário da base de dados de pares com G2252 e G2251, respectivamente, no P loop (H80) do 23S rRNA, enquanto C75 do site tRNA pares com G2553 em Um loop (H92) (18, 25, 26). Estas interacções posicionam as moléculas peptidil e aminoacil para a reacção peptidil-transferase (27), que deixa um ácido tRNA desacilo no local P, e um ácido tRNA peptidílico no local A. Um passo crítico na translocação é, portanto, o movimento subsequente da extremidade peptidil-CCA do laço A para o laço P. A estrutura do intermediário de translocação revela um estado quimérico, distinto daqueles anteriormente descritos (Fig. S18), em que o fim aceitador do peptidil-tRNA interage simultaneamente com o a e o p loops (Fig. 4). Neste estado, emparelhamento de base de C75 com G2553 do laço A é preservado, enquanto o movimento de seu tronco aceitador em uma posição próxima à do clássico p-site tRNA permite G2252 e G2253 em um laço p rearranjado para contatar a espinha tRNA nas posições 72 e 70(Fig. 4B). Assim, o fim do caule do aceitador ap/ap-tRNA é ancorado no laço P, facilitando a transferência de seus resíduos adjacentes C74 e C75 do laço a para o laço P. A76 da ap/ap tRNA é orientada de forma semelhante à observada para o tRNA vinculado o P/P clássica estado (17), com o N-acetil-valina peptidyl metade posicionado na entrada do peptídeo túnel de saída, enquanto que C74 e C75 manter suas interações com o loop do 23S rRNA (Figs. 4, S19).
Durante o processo de translocação, o 3′ aceitador final de peptidyl-tRNA move-se do (A) clássica/A de Um estado para o (B) intermediário ap/ap estado para o (C) clássico P/P estados, facilitada pela mudança conformacional na a e P loops.
A AP / ap-tRNA pode corresponder a Estados intermédios que foram caracterizados cineticamente. Estudos cinéticos fluorescentes identificaram um intermediário dependente de EF – G (INT) no qual o cotovelo peptidil-tRNA se move do local A para o local P, mas permanece apenas parcialmente reativo com a puromicina mimética aminoacil-tRNA, sugerindo que a sua extremidade CCA não é totalmente acomodada no local P (28). Estudos cinéticos nos quais uma sonda foi ligada diretamente à extremidade CCA peptidil-tRNA, identificaram intermediários de translocação dependentes da EF-G nos quais a extremidade aceitadora do peptidil-tRNA se move para o local P, mas permanece puromicina-irreativa (29). As propriedades destes intermediários são compatíveis com o estado AP/ap preso observado aqui. A estrutura deste intermediário de translocação preso começa a descrever como tRNA se move entre os locais ribossômicos A E P. Os próprios locais de ligação tRNA são dinâmicos, formando contatos simultâneos entre o a-tRNA e elementos dos locais A E P, assemelhando-se à passagem do bastão em uma corrida de revezamento (30). Isto é visto para ambas as subunidades dos anos 30 e 50. Na subunidade 30, o rearranjo do laço 966 de 16S rRNA libera G966 do site P ASL para contatar o a-site ASL à medida que ele se move para o site P 30S (Fig. 2E, F). Na subunidade 50S, os loops A E P de 23S rRNA rearrange para permitir que ambos os loops para entrar em contato com o fim 3 ‘ – acceptor do tRNA local a como ele começa sua transição para o site 50S P (Fig. 4). Estes achados mostram que a dinâmica estrutural do RNA ribossomal desempenha um papel ativo no mecanismo de translocação.