Effekt av kolesterol på strukturen av ett fosfolipid-dubbelskikt

nyckelord:

• biomembran
• molekylär simulering
• fasbeteende
• dimyristoylfosfatidylkolin
• mesoskopisk modell

i den här artikeln tar vi upp en till synes enkel termodynamisk fråga: Hur förändras området per molekyl av ett fosfolipidmembran om vi lägger till kolesterol? Denna fråga ställdes först av Leathes (1) 1925 och diskuteras fortfarande idag. Betydelsen av denna fråga hänför sig direkt till betydelsen av kolesterol för funktionen av membran av högre eukaryoter. Till exempel reglerar kolesterol membranets fluiditet och modulerar membranproteins funktion (2). Att förstå dessa mekanismer har motiverat många forskare att undersöka lipid-kolesterolinteraktionerna i detalj. Eftersom ett membran kan ses som en 2D-vätska, skulle en första uppskattning av hur området per molekyl förändras vid tillsats av kolesterol vara att anta idealisk blandning, där området per molekyl helt enkelt är ett vägt genomsnitt av de rena komponenterna. 1925 visade Leathes att man i stället för idealisk blandning observerar ett slående nonidealt beteende (1). Detta nonideala beteende kallas kondenseringseffekten (3) eftersom området per molekyl är mycket lägre jämfört med idealisk blandning. Eftersom ett membran beter sig som en inkompressibel vätska, kommer en minskning av arean per molekyl att resultera i en motsvarande signifikant ökning av dubbelskiktets totala tjocklek. En sådan ökning av tjockleken signalerar en omorganisation av membranets struktur. Eftersom förändringar i membranets struktur kan ha viktiga konsekvenser för proteinernas funktion (2) är det viktigt att ha en bättre molekylär förståelse för de kolesterolinducerade förändringarna.

olika konceptuella modeller har föreslagits för att förklara de nonideala kolesterol-lipidinteraktionerna. Exempel inkluderar kondenserade komplexmodellen (4, 5), superlattice-modellen (6) och paraplymodellen (7). Den kondenserade komplexmodellen förklarar kondensationseffekten genom att anta att kolesterol inducerar den reversibla bildningen av ett stökiometriskt kolesterol–lipidkomplex. I ett sådant komplex kondenseras membranet eftersom lipidacylkedjorna är mer ordnade. Vid en given kolesterolkoncentration finns en jämviktskomposition mellan dessa kondenserade kolesterol-lipidkomplex och vanliga lipider. Superlattice-modellen antar att kolesterolmolekylerna vid kritiska koncentrationer uppvisar en specifik långdistansordning. Paraplymodellen anser att den hydrofila delen av kolesterol är för liten och därför måste lipiderna bidra till screening av kolesterolmolekylerna från hydrofoba interaktioner med vatten. Fosfolipiderna kan bara skapa detta paraply om dessa molekyler räta ut för att göra plats för kolesterol. I dessa modeller är de underliggande mekanismerna som leder till kondensering mycket olika. Intressant är att en ny experimentell studie drog slutsatsen att deras data stödde den kondenserade komplexmodellen (8), medan en annan uppsättning experiment inte hittade någon indikation på de kondenserade komplexen och stödde paraplymodellen (9). Dessa skillnader i insikter motiverade oss att utveckla en mesoskopisk modell av ett lipid–kolesterol–vattensystem. Vi använde molekylära simuleringar för att kasta lite ljus på den laterala organisationen av kolesterol i lipidmembran och de underliggande lipid–kolesterolinteraktionerna som inducerar kondensationseffekten.

flera molekylära simuleringar av allatom och grovkorniga modeller av kolesterol i lipidbilayers har rapporterats i litteraturen (för några nya exempel, se refs. 10-13 och referenser däri). Helst skulle man vilja använda allatomsimuleringar för att studera kondenseringseffekten över ett stort antal temperaturer och kompositioner. För närvarande är dessa simuleringar dock för tidskrävande. Därför använder vi en grovkornig modell, där effektivitet uppnås genom att integrera några av detaljerna i en allatom-modell. Vår modell är baserad på modellen av Kranenburg och medarbetare (14, 15). Modellen använder explicita vattenmolekyler. Lipider och kolesterol består av hydrofila och hydrofoba partiklar (se Fig. 1). Denna modell klumpar grupper av atomer i en mesoskopisk pseudoatom. De intramolekylära interaktionerna innefattar bindningsvibrationer och bindningsböjning av vilka parametrarna har optimerats för att efterlikna strukturen hos en enda allatomfosfatidylkolinmolekyl i vatten. De hydrofila och hydrofoba interaktionerna beskrivs med mjuka repulsiva interaktioner, och parametrarna för dessa interaktioner är relaterade till löslighetsparametrarna med användning av metoden som beskrivs av Groot och Rabone (16). Tanken med denna modell är att de viktigaste drivkrafterna för kolesterol–fosfolipidblandning är de hydrofoba och hydrofila interaktionerna, vilket är slutsatsen av många experimentella studier (7, 9, 17). I vår modell är längdenheten direkt relaterad till den effektiva storleken på en pseudoatom, dvs en pseudoatom upptar en volym på 90 OC.3. Energienheten följer av matchningen av de mjuka repulsionsparametrarna för de mesoskopiska vattenpartiklarna till kompressibiliteten av vatten vid omgivande förhållanden. Modellernas enkelhet kräver en omparameterisering av dessa mjuka repulsioner om temperaturen ändras. Men i detta arbete antar vi att parametrarna är oberoende av temperaturen. Temperaturskalan ställs in genom att passa till experimentell fasövergångstemperaturer. Ytterligare detaljer och tillämpningar av denna modell finns i ref. 18.

vår modell av kolesterol, som visas i Fig. 1B, bygger på samma antaganden om Effektiv storlek och interaktioner som lipidmodellen. Efter McMullen et al. (19), gjorde vi den hydrofoba delen av kolesterolmodellen något längre än den hydrofoba delen av lipidmodellen, som syftar till att representera dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC). För enkelhet har vi antagit att de hydrofoba och hydrofila interaktionerna hos en kolesterolmolekyl liknar dem i en lipid. För att få insikt i den molekylära mekanismen för kondenseringseffekten av kolesterol har vi infört tre kolesterolliknande molekyler där vi stör den hydrofoba hydrofila balansen i molekylen: en där vi minskar den hydrofoba svanslängden (se Fig. 1C), en där vi lägger till en ytterligare hydrofob grupp (Fig. 1D), och en där vi ersätter ringen med en enkel kedja (Fig. 1E).

Fig. 2 visar det beräknade temperaturkompositionsfasdiagrammet för vattenfosfolipid-kolesterolsystemet. Fasgränserna erhölls från en visuell inspektion av ögonblicksbilderna och, mer kvantitativt, från böjningspunkterna för kurvorna som ger området per lipid, membranets genomsnittliga hydrofoba tjocklek och svansordningen och lutningsparametrarna. Dessa egenskaper beräknades som en funktion av temperatur och kolesterolhalt.

låt oss först fokusera på renlipidfaserna, och effekten av kolesterol kommer att diskuteras nästa. För pure-lipid-dubbelskiktet har fasdiagrammet beräknats av Kranenburg och Smit (14) för ett system som är fyra gånger mindre. Vi använde samma metod för att lokalisera fasgränserna som Kranenburg och Smit gjorde (14). Våra resultat är i utmärkt överensstämmelse med denna studie, vilket indikerar att effekterna av ändlig storlek är små. För den rena fosfolipiden observerar vi vid höga temperaturer en vätskefas (La) där svansarna är störda. Vid låga temperaturer beställs och lutas svansarna, vilket definierar gelfasen (L ’ C). Dessa två faser separeras av den ripplade fasen (p ’ megapixlar), där vi observerar en mikrofasseparation av domäner där dubbelskiktet är tjockt och lipiderna är ordnade och domäner där dubbelskiktet är tunt och lipiderna störda. Närvaron av dessa tre faser indikerar att det resulterande fasdiagrammet är i mycket god överensstämmelse med det experimentella diagrammet för den rena lipiden (20). Temperaturskalan ställs in genom att matcha temperaturerna för gelfasens fasövergångar till krusningsfasen (Tp) och krusningsfasen till vätskefasen (Tm) med motsvarande experimentella fasövergångstemperaturer för ren DMPC. En ytterligare jämförelse med experimentella data görs för det genomsnittliga området per molekyl i dubbelskiktet (Fig. 3A), för dubbelskiktets tjocklek (Fig. 4A), och för lipidsvansordningen (Fig. 4B). För Arean per lipid erhåller vi 56 oc 22 per molekyl jämfört med den experimentella (21) 60 oc 2 per molekyl. För tvåskiktstjockleken beräknade vi ett värde på 38,7 kg, vilket jämförs väl med det experimentella värdet på 36 kg (21), och ett liknande avtal erhålls för svansordningen (se Fig. 4B). För att beräkna området per molekyl för rent kolesterol simulerade vi ett dubbelskikt av rent kolesterol. Vi erhöll ett värde på 40,3 kg, vilket jämförs mycket bra med det senaste experimentella värdet på 41 kg (22) för ett monolager av kolesterol. Med tanke på de approximationer som gjorts i vår modell är överenskommelsen mellan de experimentella och de simulerade värdena förvånansvärt bra.

låt oss nu vända oss till effekten av kolesterol på dubbelskiktets egenskaper. Den första frågan vi kommer att ta upp är om vår modell kan reproducera kondenseffekten. Fig. 3A visar effekten av kolesterol på området per molekyl som en funktion av kolesterolkoncentrationen. Jämförelse med experimentella data visar återigen mycket bra överenskommelse. I denna figur visar vi också området per molekyl som antar idealisk blandning. Denna siffra illustrerar övertygande kondensationseffekten; området per molekyl minskar mycket mer än man kan förvänta sig på grundval av idealisk blandning. Andra experimentella data inkluderar effekten av kolesterol på dubbelskiktets svullnad (Fig. 4A) och svansorderparametern (Fig. 4B). Både experimentella data och simuleringen visar att kolesterol ökar tjockleken på dubbelskiktet och dess ordning. Även för dessa två egenskaper är våra simuleringsresultat i mycket god överensstämmelse med experimentdata. Simulering och experimentella data (Fig. 3A och 4 A och B) visar att tillsatsen av kolesterol starkt modifierar egenskaperna hos lipid-dubbelskiktet upp till 30 mol-kolesterol i 30 mol. Därefter uppnås en region där ytterligare tillsats av kolesterol endast har en liten effekt. Vid 30 mol% kolesterol har både området per molekyl och lipidsvansordningen och lutningsparametrarna värden som är typiska för gelfasen.

färgkodningen i Fig. 2 visar skillnaden mellan det simulerade området per lipid och värdet uppskattat genom att anta ideal blandning. Vi observerar att vid höga och låga temperaturer är kondensationseffekten relativt liten. Kondensationseffekten är maximal i en väldefinierad region i fasutrymme som ligger strax ovanför huvudfasövergången för den rena fosfolipiden. För att bättre förstå kondensationseffektens natur är det viktigt att förstå effekten av att tillsätta kolesterol på membranets fasbeteende.

Fig. 2 visar de viktigaste funktionerna i fasdiagrammet. De olika faserna vi observerade i våra simuleringar har också observerats experimentellt, men inte alltid för den specifika blandningen av DMPC och kolesterol (20, 23, 24). De olika experimentella studierna visar emellertid kvalitativt mycket olika fasdiagram, vilket begränsar våra möjligheter att göra en detaljerad jämförelse. Ögonblicksbilder av de olika faserna finns i Fig. 5.

vid mycket höga temperaturer har tillsatsen av upp till 50 mol% kolesterol liten effekt på membranets struktur, och vi observerar La-fasen för alla koncentrationer (24). Vid temperaturer under Tp observerar vi att kolesterol förändrar gelfasens struktur genom att hämma lutningen av lipidsvansarna, vilket orsakar bildandet av L ’ C-fasen (20) (jämför Fig. 5 D med E). Vid högre kolesterolkoncentrationer (>20%) observerar vi bildandet av små kolesterolrika kluster. Vi betecknar denna fas av LII, och denna fas visas i Fig. 5E.vid temperaturer mellan Tp och Tm är det rena dubbelskiktet i krusningsfasen och kolesterol omvandlar denna krusningsfas (se Fig. 5C) i en vätskeordnad fas (23) (Fig. 5B). Termen flytande ordnad fas introducerades av Ipsen et al. (25). Dubbelskiktets tjocklek är mellanliggande mellan vätskans tjocklek och gelfasen. Lipidsvansordningsparametrarna har värden som ligger nära gelfasen; i motsats till gelfasen är lipiderna emellertid mer störda och lutar inte. Kolesterol ökar gradvis temperaturen vid vilken La till Lo-fasövergången sker. Vid mycket höga kolesterolkoncentrationer omvandlas den vätskebeställda fasen till en gelfas (LII) när temperaturen sänks under Tm. Denna fas har observerats experimentellt för dipalmitoylfosfatidylkolin (26), men vi har inte hittat experimentella data för DMPC vid dessa förhållanden. Låt oss nu återgå till kondenseffekten. Fig. 2 visar att kondensationseffekten är maximal vid en temperatur strax över huvudövergången Tm. Anledningen är att vid dessa förhållanden är det rena dubbelskiktet i ett vätskestört tillstånd, medan tillsatsen av kolesterol till dubbelskiktet omvandlar den till en vätskeordnad fas, som har ett område per lipid som är mycket mindre jämfört med det vätskestörande tillståndet. Denna stora skillnad orsakar en stor kondenseffekt. Vid högre temperaturer förblir vätskefasen stabil för alla kolesterolkoncentrationer, vilket ger en mycket mindre kondensationseffekt. Vid lägre temperaturer har det rena lipid-dubbelskiktet ett område per lipid som är mycket närmare området per lipid i den vätskebeställda fasen, och som ett resultat är kondensationseffekten mycket mindre.

ovanstående resultat indikerar att kondensationseffekten är en direkt följd av särskilda förändringar i fasbeteendet som kolesterol inducerar. I litteraturen finns det olika spekulationer om de aspekter av kolesterolstrukturen som är specifikt ansvariga för dess kondenserande effekt. Till exempel är paraplymodellen baserad på uppfattningen att jämfört med fosfolipider är den hydrofila delen av kolesterol mycket mindre och behöver fosfolipiden, som ett paraply, för ytterligare screening från interaktioner med vatten. Detta tyder på att en ytterligare hydrofil grupp skulle ändra egenskaperna helt. En annan viktig faktor är den skrymmande ringstrukturen; om vi ersätter ringen med en svans får vi en molekyl som liknar mer en alkoholmolekyl (27). Att förkorta den hydrofoba svansen skulle dock ha liten effekt. Fig. 1 visar de modifierade kolesterolmolekylerna som efterliknar dessa förändringar. Faktum är att resultaten i Fig. 3B visar att förkortning av kolesterolets svans visar samma kondenseffekt. Men Fig. 3B visar att för båda andra modifieringar av kolesterolmolekylen, tillsats av en ytterligare hydrofil grupp och ersättning av ringen med en linjär kedja, observeras ingen kondenseringseffekt. Vi observerar motsatt effekt: att lägga till dessa molekyler gör att dubbelskiktet blir mer expanderat jämfört med idealisk blandning. Effekten av (mindre) alkoholer på området per molekyl har uppmätts experimentellt, och experimentella data visar också en ökning (28). Nära kopplat till detta observerade vi att för båda fallen i fasdiagrammet var vätskefasen stabil över hela koncentrationsområdet. Faktum är att vi observerar att tillsats av dessa molekyler minskar huvudövergångstemperaturen, och därför finns det ingen region i fasdiagrammet där det finns en stor kondensationseffekt.

simuleringar med dessa strukturella variationer av kolesterol indikerar hur överraskande subtil mekanismen är. Huvudövergången i ett rent dubbelskikt är mycket känsligt för de hydrofoba interaktionerna. Lipidernas huvudgrupper skärmar de hydrofoba svansarna från vattnet. Vid höga temperaturer är området per lipid högt, och denna screening är långt ifrån optimal; men vid dessa förhållanden dominerar kedjeentropin. Att minska temperaturen gör det allt viktigare att screena de hydrofoba interaktionerna och vid huvudövergången inducerar så småningom en beställning av kedjorna. En viktig aspekt är att förstå hur kolesterol destabiliserar vätskefasen. Kolesterol har ett mindre hydrofilt huvud och är därför mindre effektivt för att skydda de hydrofoba interaktionerna. Vid höga temperaturer kan lipid-dubbelskiktet rymma detta, men vid lägre temperaturer kan lipiderna bara bidra till screening av kolesterolet genom att minska sitt område per lipid. Detta orsakar den observerade beställningen och förklarar varför huvudövergången ökar. De två förändringarna vi introducerade för kolesterolstrukturen påverkar dess hydrofoba screening; i båda varianterna försvinner den inneboende underskärningen av kolesterol. Om dessa molekyler läggs till dubbelskiktet finns det inget behov av ytterligare screening av de hydrofoba interaktionerna, och dessa molekyler förhindrar bildandet av en ordnad fas.

låt oss jämföra våra observationer med tidigare modeller som har introducerats för att förklara kondenseffekten. För det första ger vår modell ingen indikation på långdistansbeställning som antas i superlattice-modellen. Implicit i både paraplymodellen och de kondenserade komplexen är antagandet om någon form av lokal organisation. Till exempel i paraplymodellen antas det att en lipidmolekyl kan screena en eller två närliggande kolesterolmolekyler (se t.ex. ref. 2). Våra simuleringar visar en mycket mer oordnad struktur där vi inte kan identifiera dessa ordnade strukturer. Vid denna tidpunkt är det viktigt att komma ihåg att vår modell innehåller många antaganden, och detta väcker frågan om slutsatserna vi drar från våra simuleringar är relevanta för experimentsystemen. Vi blev mycket förvånade över att se att vi kunde få ett så rikt fasbeteende genom att använda en grovkornig modell som använder rent repulsiva krafter. Vår modell ger en mycket rimlig kvantitativ beskrivning av de senaste experimentella uppgifterna om dubbelskiktets struktur. Den andra intressanta aspekten är att våra beräkningar förutspår att kondensationseffekten är maximal i ett smalt temperaturområde över huvudövergången. Det kan vara möjligt att verifiera detta experimentellt. Ett mycket strikt test av vår modell skulle ha varit en detaljerad jämförelse med experimentfasdiagrammet. I detta sammanhang är det uppmuntrande att de faser vi har hittat har observerats experimentellt, men inte alltid för exakt det simulerade systemet. Genom att noggrant välja de experimentella data som överensstämmer med våra simuleringar kan vi till och med hävda mycket bra överenskommelse. En möjlig orsak till oenigheten mellan de olika experimenten är att olika tekniker används, och inte alla tekniker är lika känsliga för skillnaderna i strukturen i de olika faserna. Vi hoppas att kombinationen av ett fasdiagram och detaljerad information om strukturen i de olika faserna ger några riktlinjer för huruvida en viss experimentell teknik kan identifiera en viss fasövergång.