alla metoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. Informerat samtycke erhölls från alla ämnen.
Material
följande silverförband jämfördes: Acticoat (Smith &Nephew, UK; hänvisas till i denna artikel som Ac), Aquacel Ag + Extra( Convatec, UK; hänvisas till i denna artikel som Aq), Silvercel Hydro-alginat (Systagenix, UK; Ialugen Plus (IBI, Tjeckien, som i denna artikel kallas Ia).
andra kemikalier erhölls från Sigma–Aldrich (St. Louis, USA) om inget annat anges.
beredning av extrakt
i flera analyser användes extrakt från förband snarare än själva förbandet. Dessa extrakt framställdes med användning av fysiologisk saltlösning (0,9% (w/v) NaCl) eller cellodlingsmedier kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Förhållandet mellan förbandet och lösningen var 1 cm2 per 4 mL lösning. Extraktion utfördes för 72 h vid RT med konstant omröring. Extrakten steriliserades genom att passera dem genom ett 0,2 kg filter och lagrades vid 4 kg tills de användes.
mätning av silverkoncentration
silverkoncentrationerna i förband och extrakten av förband mättes med användning av ICP-OES. Silverkoncentrationen utvärderades också i svin ex vivo hudprover. 10-70 mg av varje prov överfördes till ett PTFE-kärl för mikrovågsförtunning. Sedan 1 mL koncentrerad salpetersyra (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tjeckien), 0.8 mL koncentrerad saltsyra (trace analysis grade, Analytika Ltd., Tjeckien) och 0,2 mL väteperoxid (p.a. 30%, Penta Ltd., Tjeckien) lades till. Provet digererades vid 150 C i 5 min och sedan, i det andra steget i samma cykel, vid 200 C i 10 min. Efter matsmältningen överfördes provet kvantitativt med 0,2 mL väteperoxid och avjoniserat vatten.
analysen utfördes med ett ICP – oes-instrument (Radial 725, Agilent Technologies, Australien) utrustat med en pneumatisk Sea-spray nebulisator och cyklonisk sprutkammare. Kvantifiering baserades på extern kalibrering. Metodnoggrannhet och tillförlitlighet testades med användning av svinhudprover spikade med kända koncentrationer av Ag från en certifierad referenslösning (Analytika Ltd., Tjeckien).
Scanningelektronmikroskopi
Scanningelektronmikroskopi (SEM) analyser utfördes med användning av ett Zeiss Ultra Plus-instrument (Zeiss, Tyskland). Prover belades med ett tunt lager av Au/Pd i en kvorum SC7620 sputterbeläggning. Bilder togs av två sekundära inlens-och SE2-elektrondetektorer för högre respektive lägre förstoring. Skanningsparametrarna var följande: accelerationsspänning, 3,5 kV; sondström, 36 pA; och tryck i kammaren, ~ 7 kg 10-5 Pa.
EDX-bilder togs med Zeiss Ultra Plus-instrumentet. Röntgenkartor och spektra togs av en X-MaxN 80 röntgendetektor (Oxford Instruments, Storbritannien). EDX-parametrarna var följande: accelerationsspänning, 10 kV; sondström, 300 pA; arbetsavstånd, 8,5 mm; och processtid, 4 .
direkt oxidativ aktivitet av förband
genereringen av ROS i cellfria förhållanden utvärderades med användning av 3,3′, 5, 5 ’ -tetrametylbensidin (TMB) som substrat för pepparrotperoxidas (HRP). Cirklar med diameter 6 mm skars ut ur förbandet och testades. Kortfattat bestod arbetslösningen av 0, 1 mg/mL TMB (stamlösning c = 1 mg/mL i DMSO) blandad 1:9 med 0, 05 M citratfosfatbuffert (pH = 5) och HRP (slutlig c = 0, 16 IE/mL). Varje del av förbandet nedsänktes i 0,5 mL av arbetslösningen och prover (25 occyl) uppsamlades vid 0, 5, 7,5 och 10 min. Omedelbart efter insamling blandades proverna i förhållandet 1: 1 med 0,16 M H2SO4 och absorbansen lästes vid 450 nm (referensvåglängd = 540 nm) med användning av ett Nanodrop OneC-instrument (ThermoFisher Scientific, US). 30% H2O2 användes som en positiv kontroll. Bakgrundssignalen (blank lösning) subtraherades.
silverpenetration i deepiteliserad hud
vi använde statisk diffusion Franz-celler för att undersöka silverpenetration i deepiteliserad hud. Huden erhölls från ett lokalt slakteri (Bocus, Letohrad, Tjeckien) och skars ut från den inre delen av grisens öron. Håret var rakat, huden inkuberades i PBS (60 kcal C, 90 s) och epidermis avskalades. Den genomsnittliga tjockleken på den epiteliserade huden var 2 mm. hudstyckena placerades i en kammare och täcktes med en testad silverförband eller en bit gasbindning. Varje donatorkammare fylldes med 0,3 mL nhdf-odlingsmedium med 10% FBS. Acceptorkammaren innehöll 0,7 mL odlingsmedium. Diffusionscellerna inkuberades vid 37 kcal C under 24 eller 48 timmar. Efter inkubation sköljdes huden med PBS, och de delar av huden som separerade donator-och acceptorkamrarna analyserades med avseende på silverinnehåll med användning av ICP-OES, såsom beskrivits ovan. Mängden silver som trängde igenom den deepiteliserade huden mättes i givarvätskan. Tre oberoende replikat bereddes vid båda tillfällen.
odling av ex vivo-hud med förband
färsk (1-2 h) svinöron (Bocus) rengjordes noggrant med tvål och Betadin (en PVP-jodlösning, Egis Pharma, Ungern) och sköljdes med vatten. Hudstyckena (1 1 cm i 1 cm) från auriklarna skars ut och placerades i antibiotikalösning (penicillin–streptomycinlösning, 10 000 U/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin) i 30 minuter vid 37 C i atmosfären O2 och CO2. Hudprover med intakt epidermis placerades dermala sidan uppåt i 6-brunns odlingsplattor med 3 mL NHDF-medium kompletterat med 10% FBS och täcktes sedan med 1 msk 1 cm utvalt silverinnehållande förband eller sterilt kontrollgasväv indränkt med 300 ml odlingsmedium. Proverna inkuberades för 24 eller 48 h. Därefter sköljdes huden med PBS och var och en av hudexplanterna delades upp i tredjedelar för histologisk undersökning (4% PFA − fixering vid 4 kcal C), proteinanalys med hjälp av Western blot (snap-frysning med flytande kväve) och qPCR (över natten i Rnalater (Thermo Fisher Scientific), sedan vid-80 kcal C).
histologisk färgning
den autometallografiska färgningen av silver antogs enligt Danscher et al.49. Bilder fångades med hjälp av ett Eclipse 50i-mikroskop med en bifogad DS-Fi1-kamera (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).
för immunofluorescens av yH2AX, histologiska sektioner på Superfrost Plus glasskivor (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) deparaffiniserades och inkuberades över natten med primär antikropp (1:1000, ANTI-PHOS-HIST H2A.X S139, klon JBW301, Millipore, MA, USA). De inkuberades sedan i 1 h med en sekundär antikropp (ab150114, Abcam, Cambridge, Storbritannien; utspädning 1:10 000) och monterades på glidbanor med ProLong Diamond Antifade Mountant med DAPI (ThermoFisher Scientific). Bilder fångades med ett Nikon Eclipse Ti (Nikon, Yokohama-Shi, Japan) fluorescerande mikroskop.
genuttryck
Svinhud efter inkubation med förband bearbetades för RNA-isolering, cDNA-syntes och qPCR-genuttryck som beskrivits tidigare av Klein et al.50 Taqman realtids PCR-analyser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) som användes för qPCR var: DNAJA1, Ss04326380_g1; PLK3, Ss03375596_u1; HSPH1, Ss03388958_m1; GADD45G, Ss04246840_g1. RPL13A, Ss03376908_u1. Tröskelcykelvärdena normaliserades till rpl13a-hushållningsgenen och relaterade till gaskontrollprover för den specifika tiden (24 – eller 48-h−intervallet) med 2-Occylct-Metoden51. Sex oberoende prover för varje behandling och tid mättes och genomsnitt. Betydelsen av skillnader i genuttryck i förhållande till gasbindkontroll utvärderades med hjälp av studentens t-test för varje silverförband under den angivna tiden.
Western blotting
för efterföljande Western blot-analys framställdes vävnadslysat från frusen svinhud. Användning av en skalpell i en droppe lysbuffert (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% natriumdeoxikolat; 1% natriumdodecylsulfat; 4% urea) skars huden i små bitar, som därefter homogeniserades i 350 occyl av lysbufferten med användning av en rostfritt stål 5 mm pärla och en vävnadshomogenisator (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Tyskland) för 10 min vid 25 Hz. Proteinkoncentrationen mättes med hjälp av BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific).
proteiner i lysater separerades med användning av 4-15% gradient SDS-sida och överfördes till polyvinylidendifluoridmembran. För att detektera specifika proteiner inkuberades membran över natten i en blockerande buffert (20 mM Tris; 137 mM NaCl; 0,05% Tween 20; 5% torkat mjölkpulver med låg fetthalt) med den primära antikroppen fosfohiston H2A. X (20E3) (1: 1000; cellsignalering, USA). β-aktin användes som ett protein mängd lastkontroll (1:2000; Santa Cruz, USA). Membranen utvecklades med HRP-konjugerad anti-kanin eller anti-mus Ig med användning av kemiluminescerande detektion för att visualisera signaler (Clarity Western ECL substrate; Bio-Rad, US). Signalerna skannades och utvärderades med ett Alliance 9.7 Chroma Chemiluminescence Imaging System (UVItec Limited, Storbritannien).
antibakteriell aktivitet
agardiffusionsmetoden användes för att jämföra förbandets antimikrobiella aktiviteter. Ett provstycke (1 cm2) av varje förband inkuberades på en nyinokulerad petriskål med antingen Staphylococcus aureus eller Pseudomonas aeruginosa; dessa stammar isolerades från humana kroniska sår, karakteriserades och odlades enligt tidigare beskrivning52. Dessutom jämfördes den antimikrobiella effektiviteten hos förbandsextrakt (framställda i RPMI-medium med 10% FBS, såsom beskrivits ovan) med hjälp av mikrodilutionsmetoden53. Optisk densitet mättes med en Ensight Multimode plate-läsare (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) vid 600 nm för 24 h (skakning, 37 kcal C).
cellodling
normala humana dermala fibroblaster från vuxen hud (nhdf) köptes från Lonza (Basel, Schweiz). NHDF odlades i Dulbecco ’ s modified Eagles low glucose medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS, glutamin (0,3 mg/mL), glukos (4 mg/mL), penicillin (100 enheter/mL) och streptomycin (0,1 mg/mL) i 75 cm2 kulturflaskor under 5% CO2 och vid 37 kg c fram till femte passagen. Hacat keratinocytes köptes från H Ubiklzel Diagnostika (K Ubikln, Tyskland) och odlades på samma sätt men utan tillsats av glukos till mediet.
Viabilitetsmätning
fem tusen celler per brunn såddes i en 96-brunnsplatta med 200 oc av odlingsmediet med 10% FBS i en inkubator (37 oc C, 5% CO2) över natten. Följande dag behandlades cellerna med 200 occl av en utspädningsserie av extrakt från förbandet (100%, 50%, 20%, eller 10% av det ursprungliga extraktet utspätt med odlingsmedium kompletterat med 10% FBS) för 24, 48 och 72 timmar. Kontrollceller behandlades med ett standard 10% FBS odlingsmedium. Viabilitet mättes som beskrivits tidigare 54 Med användning av 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) – analysen. MTT-stamlösning (20 oC; C = 5 mg/mL) tillsattes till cellodlingsmediet i varje brunn. Plattorna inkuberades i 2,5 h vid 37 kcal C. Därefter avlägsnades MTT-lösningen, 220 kg lyslösning (1:1 propan-2-ol med DMSO, 10% (w/v) Triton X-100 och 0,37% (w/v) HCl) tillsattes och LYS utfördes i 30 minuter vid rumstemperatur på en roterande skakare (150 rpm). Absorbansen lästes vid 570 och 690 nm med en EnSight Multimodplattläsare (PerkinElmer, USA). Uppgifterna behandlades i Kaleido (PerkinElmer, USA). Den slutliga absorbansen beräknades som A = A570-A690. Förändringen i livskraften hos behandlade celler i förhållande till kontrollceller beräknades som change = (ett prov/en kontroll – 1) 100.
direktkontaktinhiberingsanalys
celler såddes vid en densitet av 300 000 celler per brunn i en 6-brunnsplatta och inkuberades i odlingsmediet kompletterat med 10% FBS vid 37 C och under 5% CO2 tills sammanflödet uppnåddes. Förband skars i kvadrater av 1 cm2, placerades på cellskiktet och inkuberades med standardodlingsmediet för 6 h. kontrollceller behandlades endast med mediet. Därefter tvättades cellerna med PBS och fixerades med 4% paraformaldehyd i 15 minuter. Cellerna färgades med 0,1% (w/v) kristallviolett lösning (upplöst i 10% etanol) i en timme och sköljdes sedan med vatten. Hämningszonerna fotograferades med en Canon EOS 80D EF – S 18-55 mm f digitalkamera (Canon).
fluorescerande färgning av celler
för DNA-skadeanalys såddes nhdf-celler på mikroskopiska diabilder i en 6-brunnsplatta med en densitet 2 105 kcal per brunn och fick klibba över natten. På följande dag behandlades cellerna med 5 utspädda förbandsextrakt och inkuberades i 24 h. därefter fixerades cellerna med användning av 4% PFA under 15 min. Efter permeabilisering och blockering inkuberades glidbanorna med en primär Anti-yH2AX kaninantikropp (cellsignalering, US; 1:500 utspädning i en blockerande buffert—20% FBS, 0,3 m glycin, 0,05% Tween 20 i PBS; över natten; 4 msk C). Detektion utfördes med användning av en sekundär antikropp märkt med Alexa Fluor 555 (Abcam, UK; 1:500 i en blockerande buffert; 1 h, RT). Glidbanorna monterades med ProLong Diamond Antifade Mountant med DAPI (ThermoFisher Scientific). Efter att bilderna torkades togs bilder med hjälp av ett Eclipse Ti-fluorescerande mikroskop (Nikon, Yokohama-Shi, Japan).
intracellulär oxidativ stress detekterades med användning av en DCF-DA-sond, som är känslig för den totala ROS-koncentrationen inuti celler. Cellerna såddes över natten i en 24-brunnsplatta och märktes sedan med DCF-DA (1 kg/mL) i 15 minuter, varefter de behandlades med 5 kg utspädda förbandsextrakt och inkuberades vid 37 kg C och under 5% CO2. 5 mM H2O2 användes som en positiv kontroll. Den gröna fluorescensen av DCF registrerades var 15: e minut under en 90 min inkubationsperiod med hjälp av ett Incucyte S3-automatiserat mikroskop (Essen Bioscience, USA). Kvantifieringen av intracellulär fluorescens utfördes i Fiji-programvara enligt den metod som beskrivs av Excepibepa55.
bestämning av oxidativ burst av neutrofiler i helblod
en oberoende etikutskott godkände blodprovsamlingen för neutrofil oxidativ burstanalys och MAT (Ethical Committee for Research vid Masaryk University, Brno, Tjeckien, godkännande nr. EKV-2018-083). Alla givare gav sitt skriftliga samtycke.
den oxidativa burst (ROS-produktion) av blodfagocyter bestämdes i utspätt helblod med luminolförstärkt kemiluminescens (CL) med användning av en lm-01T mikroplate luminometer (Immunotech, Tjeckien). I korthet bestod reaktionsblandningen av 6 MIKL helblod i 54 MIKL rpmi-1640 tillväxtmedium blandat med 60 MIKL förbandsextrakt i fysiologisk saltlösning eller ett FBS-kompletterat medium. Denna blandning inkuberades vid 37 kcal C under 20 minuter. Strax före mätningen började vi lägga till 1 mM luminol (en stamlösning av 10 mM luminol i en 0,2 M boratbuffert) (molekylära prober, USA). Vi bestämde spontan ROS-produktion och ROS-produktion inducerad av opsoniserade zymosanpartiklar (OZP—0.1 mg/mL) (Sigma-Aldrich, USA) eller phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA-0.8; Sigma-Aldrich, USA). Obehandlade prover utan de testade extrakten utvärderades som kontroller. Analyserna kördes i dubbletter. Kemiluminescens registrerades kontinuerligt i 90 minuter vid 37 CCB och uttrycktes som relativa ljusenheter (RLU). Vi bestämde den totala mängden ROS-produktion från det integrerade området under kemiluminescenskurvan.
Monocytaktiveringstest (MAT)
MAT utfördes i 10 kg saltlösning utspätt hepariniserat humant helblod. Blodprover samlades in från fem friska givare, poolade och späddes med saltlösning. De utspädda blodproverna inkuberades med cirklar med 6 mm diameter skurna från förband i sterila mikrotuber i 24 timmar vid 37 kcal C. parallellt, lipopolysackarid (LPS, slutlig c = 0. 25 IE/mL; Endotoxinstandard E-Toxat; Sigma, US) tillsattes till den andra serien av prover inkuberade med förbandsprover för att stimulera ett medfödd immunsvar mot bakterier. Blodceller sedimenterade under inkubationen och lämnade en övre fas av saltlösning utspädd plasma. Efter inkubation uppsamlades 200 oc-l av varje saltlösning-utspätt plasmaprov och analyserades omedelbart i duplikat för IL – 6 med användning av ett IL-6 humant obestruket ELISA-Kit enligt tillverkarens protokoll (ThermoFisher Scientific, US). Absorbans lästes med hjälp av en EnSight Multimode Plate Reader (PerkinElmer, US) och den slutliga IL-6-koncentrationen beräknades av Kaleido SW (Perkin Elmer, US). De återstående plasma-och sedimenterade cellerna lagrades vid 4 kg C för bedömning av hemolys och toxicitet.
hemolys
hemolys detekterades i den återstående saltspädda plasman och sedimenterade celler från MAT. Efter centrifugering överfördes 100 occyl av varje prov till en 96-brunnsmikroplatta och absorbansen mättes vid 550 nm. 1% Triton X – 100 användes som en positiv kontroll.
LDH-frisättning
toxiciteterna hos silverförband till blodceller utvärderades med hjälp av laktatdehydrogenas (LDH) – analys (Cytotoxicity Detection KitPLUS, Roche, Schweiz) enligt tillverkarens instruktioner. Två källor till blodceller användes-humant helblod inkuberades med silverförband som i matta och isolerade neutrofiler. Absorbansen som användes för bakgrundskorrigering mättes i tomma prover utan LDH-reagenset. Resultaten rapporteras som absoluta värden för optisk densitet jämfört med ett obehandlat prov.
statistisk analys
Om inget annat anges användes Student-t-testet för att utvärdera den statistiska signifikansen av skillnader mellan prover och obehandlade kontroller.