introduktion
Kcat är omsättningsnumret-antalet substratmolekyl som varje enzymplats konverterar till produkt per tidsenhet. Om du känner till koncentrationen av enzymställen kan du passa Kcat istället för Vmax när du analyserar ett substrat mot hastighetskurva.
modellen
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X är substratkoncentrationen.
Y är enzymhastighet.
kcat är omsättningsnumret, antalet gånger varje enzymplats omvandlar substrat till produkt per tidsenhet. Detta uttrycks i inversen av tidsenheterna för Y-axeln. Till exempel, om Y är i mikromoler av substrat per minut, är kcat antalet molekyler av substrat som produceras per katalytisk plats per minut.
Km är Michaelis-Menten-konstanten, i samma enheter som X. Det är substratkoncentrationen som behövs för att uppnå en halv maximal enzymhastighet.
Et är koncentrationen av enzymkatalytiska ställen. Om enzymet har flera underenheter, notera att Et är koncentrationen av katalytiska ställen, som kan vara större än koncentrationen av enzymmolekyler. Y-värdena du anger är enzymhastighet som anges i koncentrationsenheter per tid. Et måste anges i samma koncentrationsenheter (medan tidsenheterna definieras av kcat).
Vmax är den maximala enzymhastigheten i samma enheter som Y. det visas inte direkt i modellen ovan. Det är hastigheten hos enzymet extrapolerat till mycket höga koncentrationer av substrat, så det är nästan alltid högre än någon hastighet som mäts i ditt experiment. Det beräknas genom att multiplicera et gånger kcat.
förhållande till Michaelis-Menten-modellen
kurvan som visas ovan är identisk med kurvan definierad av Michaelis-Menten-modellen. Du får identiska kurvor när du passar endera modellen till dina data och identiska värden för Km. Michaelis-Menten-modellen hittar Vmax, vilket är den maximala enzymhastigheten som extrapoleras ut till mycket höga koncentrationer av substrat. Det uttrycks i samma enheter som du använde för att ange dina y-värden (enzymaktivitet). Vanligtvis är det enkelt att uttrycka detta (eller konvertera till ) mol/minut/mg protein. Vmax bestäms av hur många enzymställen som finns (Et) och den hastighet med vilken enzymet kan omvandla substrat till produkt (kcat).
Om du känner till koncentrationen av enzymställen som du har lagt till i analysen (Et) kan du montera den katalytiska konstanten Kcat med hjälp av modellen ovan.
Vid beräkning av Kcat avbryter koncentrationsenheterna, så Kcat uttrycks i enheter med invers tid. Det är omsättningsnumret-antalet substratmolekyl som varje enzymplats omvandlar till produkt per tidsenhet.
montera modellen med Prisma
1.Skapa en XY-datatabell. Ange substratkoncentration i X och enzymhastighet i Y. Om du har flera experimentella förhållanden, placera den första i kolumn A, den andra i kolumn B, etc. Du kan också välja Prisms provdata: enzymkinetik-Michaelis-Menten.
2.När du har angett data klickar du på Analysera, väljer icke-linjär regression, väljer panelen för enzymkinetikekvationer och väljer Kcat.
3.Du måste begränsa Et till ett konstant värde, baserat på andra experiment. För att begränsa värdet på Et, gå till fliken begränsa i den icke-linjära regressionsdialogrutan, se till att rullgardinsmenyn bredvid Et är inställd på ”konstant lika med” och ange värdet. För exempeldata anger du 100 som et-värde.
om du inte vet värdet på Et kan du inte passa kcat, utan istället ska passa Vmax. Det är inte möjligt för Prism att passa både kcat och Et, eftersom de två parametrarna är sammanflätade och en substrathastighetskurva ger ingen information om deras individuella värden.
4.Med provdata rapporterar Prism att Km= 5.886 med ett 95% konfidensintervall som sträcker sig från 3.933 till 7.839. Det bästa passningsvärdet för kcat är 13,53 med ett 95% konfidensintervall som sträcker sig från 11,97 till 15,09.
anmärkningar
•se listan över antaganden för alla analyser av enzymkinetik.
•denna ekvation passar exakt samma kurva som ekvationen som passar Vmax, snarare än omsättningsnumret Kcat. Produkten av Kcat times Et (koncentrationen av enzymställen) är lika med Vmax.
•denna ekvation är relaterad till ekvationen för allosteriska enzymer. Den allosteriska modellen lägger till en ytterligare parameter: Hill slope h. när h är lika med 1,0 är de två modellerna identiska.