det finns ofta mycket förvirring över betydelsen av ”enzymenheter”, ”enzymaktivitet” och ”specifik enzymaktivitet”. Denna guide förklarar dessa nyckelbegrepp i enkla termer och diskuterar enzymanalysdesign och vikten av att arbeta i ’linjärt intervall’. Vi överväger också standardkurvor och om du ska plotta koncentration eller absolut mängd produkt på x-axeln. Några tips om att ställa in analyskontroller och subtrahera ämnen diskuteras. Slutligen förklarar vi hur enzymaktivitetsvärden beräknas och vi ger en enkel översikt över kinetiska ekvationer.
definitioner av Enzymenheter
enzymologi skulle vara mindre komplicerat om alla använde samma enhetsdefinition. En standardenhetsdefinition ges nedan:
1 enhet (U) är mängden enzym som katalyserar reaktionen av 1 umol substrat per minut (definition a).
i de flesta r&d-inställningar är 1 umol substrat faktiskt ganska mycket material och andra definitioner kan föredras för att undvika att uttrycka kvantiteter i fraktioner av enheter. Följande icke-standarddefinition används vanligtvis:
1 enhet (U) är mängden enzym som katalyserar reaktionen av 1 nmol substrat per minut (definition B).
Observera att förändringen i definitionen har en djupgående effekt på det angivna antalet enheter, dvs 1 enhet enzym enligt definition A skulle motsvara 1000 enheter enligt definition B!
Du kan också se enzymenheter uttryckta som milli-enhet (eller mU) vilket helt enkelt betyder en tusendel av en enhet, oavsett hur enheten har definierats.
det är uppenbart att den faktiska mängden av ett enzym i ett rör inte ändras helt enkelt genom att ändra enhetsdefinitionen, men försiktighet krävs när man jämför aktiviteterna hos prover från olika leverantörer. Så länge enhetsdefinitionerna tillhandahålls kan du omvandla det angivna antalet enheter till nmol per minut, vilket är entydigt och gör att giltiga jämförelser kan göras.
för tydlighet i ditt eget arbete kanske du föredrar att använda ’ nmol per min ’(eller ’umol per min’), men om konstant upprepning krävs så har den mycket kortare termen ’enhet’ sina attraktioner.
Vad är ’enzymaktivitet’
aktivitet anges i enheter per ml (U / ml), med andra ord nmol per min per ml (om enhetsdefinition B har antagits). Således är aktivitetsvärden uttryckta i enheter också föremål för en illusorisk 1000-faldig ’ökning’ om man växlar från enhetsdefinition A till enhetsdefinition B. Återigen kan det inte finnas någon förvirring om aktivitet uttrycks i termer av nmol per min per ml snarare än enheter per ml.
eftersom aktivitet avser koncentration följer att två injektionsflaskor med enzym kan innehålla samma antal enheter (totalt) men har olika aktiviteter (koncentrationer).
Vad är specifik enzymaktivitet?
specifik enzymaktivitet (anges vanligtvis helt enkelt som ’specifik aktivitet’) är antalet enzymenheter per ml dividerat med koncentrationen av protein i mg/ml. Specifika aktivitetsvärden anges därför som enheter / mg eller nmol/min/mg (om enhetsdefinition B tillämpas).
specifik aktivitet är ett viktigt mått på enzymrenhet och värden för olika satser av ett rent enzym bör vara desamma, inom normalt experimentellt fel.
seriella utspädningar av en enzymlösning kommer att ha olika enzymaktivitetsvärden, men identiska specifika aktivitetsvärden eftersom vid beräkning av specifik aktivitet täljaren (enheter/ml) och nämnaren (mg/ml) påverkas lika av provutspädning.
även om specifik aktivitet skiljer sig mycket från aktivitet, är beräkningen av specifik aktivitet ändå beroende av aktivitetsvärdet, och därför kommer det angivna specifika aktivitetsvärdet också att vara beroende av enzymenhetsdefinitionen. Satser som ligger under det förväntade specifika aktivitetsvärdet kan innehålla föroreningar eller enzymmolekyler som har blivit denaturerade.
faktorer som påverkar enzymaktivitet
i det här avsnittet diskuterar vi varför ett enzym kan ha olika uppmätta aktivitetsvärden i olika laboratorier. Med detta menar vi verkliga skillnader i uppmätt aktivitet, inte uppenbara skillnader orsakade av användningen av olika enhetsdefinitioner.
de förhållanden under vilka en analys utförs kommer att påverka de rapporterade aktivitetsvärdena. Till exempel utförs analyser typiskt vid en temperatur mellan 20-37 kg C. generellt sett kommer ett enzym att vara mer aktivt vid 37 kg C än vid 20 kg C.
definitionen av enzymenheten skulle uttryckas bättre sålunda:
1 enhet (U) är mängden om enzym som katalyserar reaktionen av 1 nmol substrat per minut under standardbetingelser.
tyvärr är termen ”standardvillkor”öppen för tolkning och det kan finnas olika användarinställningar, åtminstone i r&d-miljöer. Således kan tio olika forskningslaboratorier (helt korrekt) beräkna olika aktiviteter för samma enzymlösning. De flesta forskningslaboratorier etablerar sina egna ’standardvillkor’ och kontrollerar varje nytt parti internt. I kliniska inställningar definieras ’standardvillkor’ uttryckligen och alla laboratorier krävs för att köra identiska analyser.
utveckla analyser och vikten av linjärt intervall
aktivitetsvärdet (enheter / ml) för ditt enzym är den viktigaste parametern när du utvecklar en analys. Detta beror på att volymen (dvs. antalet enheter) som du lägger till bestämmer mängden substrat som omvandlas till produkt. Kom ihåg att 1 enhet katalyserar omvandlingen av 1 nmol substrat per minut (definition B).
de rapporterade enheterna / ml kan ge dig en grov uppfattning om hur mycket enzym som ska tillsättas, men eftersom aktivitetsvärdet kanske inte har bestämts i ett test som är identiskt med ditt, är det vanligt att förbereda seriella utspädningar av enzymet (t.ex. loggutspädningar initialt) och att testa en fast volym av varje utspädning. Beroende på analyssignalen (som kommer att relateras till mängden omvandlat substrat) kan ett andra experiment krävas för att komma in på en lämplig utspädning.
vad är den bästa utspädningen? För att svara på detta måste vi tänka på den viktigaste aspekten av analysdesign – linjärt intervall. Det är viktigt för kvantitativt arbete att fungera i ett område där en plot av analyssignal (ofta absorbans) kontra enzymkoncentration är linjär. De flesta analyser är linjära om graden av substratomvandling är mindre än 15%, förutsatt att det inte finns några andra begränsande faktorer. Genom att fastställa analystiden (t.ex. 30 min) och temperaturen (t. ex. 25oC) kan omvandlingsgraden styras helt enkelt genom att justera en parameter, dvs antalet tillsatta enzymenheter.
detta illustreras grafiskt i Figur 1 med utspädningar uttryckta som reciprokaler (dvs. utspädning av 1/10 = 0,1 på x-axeln). Din egen plot kan skilja sig åt i sin form och linjära intervall men vid mycket hög enzymkoncentration kommer utan tvekan analyssignalen inte att öka i proportion till mängden tillsatt enzym.
analysen i Figur 1 är linjär upp till optisk densitet (OD) 2,5 och en utspädningsfaktor på 0,02 (1/50 utspädning av enzym) skulle vara idealisk för analysarbete, eftersom det ger en stor signal (~1,5) och ligger i mitten av det linjära området. Beräkningar baserade på resultat för utspädningsfaktorer i intervallet mellan 0,04 och 0,12 (dvs. regionen med reducerad lutning) kommer att underskatta den verkliga nivån av enzymaktivitet eftersom något tydligt begränsar storleken på analyssignalen.
många faktorer kan fungera för att begränsa det linjära intervallet och intervallet varierar från analys till analys. En vanlig orsak till icke-linjäritet är överdriven konsumtion av substrat, vilket kan orsaka reaktionshastigheten att falla, men begränsningar av de optiska komponenterna i plattläsaren (eller vilken mätanordning som används) kan också vara betydande. De flesta plattläsare kan till exempel inte på ett tillförlitligt sätt mäta absorbansvärden över 3 och denna begränsning gäller oavsett procentandelen av substratet som har omvandlats till produkt.
Fig 1. Även om det inte annars diskuteras i denna guide, bör man också vara medveten om att enzymer kan denaturera över tiden, särskilt om de är mycket utspädda, och produkterna från vissa reaktioner kan hämma enzymet. Det finns faktiskt andra möjliga orsaker till icke-linjärt beteende men det är vanligtvis relativt lätt att hitta det linjära området genom försök och fel med seriella utspädningar av enzymet som beskrivits ovan.
Analystid och temperatur
dessa parametrar kan också påverka det linjära området eftersom de påverkar graden av substratomvandling. Till exempel kan en analys vara linjär efter 15 min, men vid 60 minuter kan för mycket substrat ha konsumerats. I denna situation måste du minska mängden enzym för att kunna köra din analys i 60 minuter. Samma överväganden gäller för analystemperatur eftersom det också kan påverka reaktionshastigheten.
de flesta människor antar en analystid på någonstans mellan 15 min och 60 min. Mycket korta tider (t.ex. 2 min) ska undvikas eftersom en liten fördröjning i att stoppa reaktionen kommer att leda till ett signifikant fel i beräkningarna av aktiviteten. Det är viktigt att se till att reagenser som förvaras i kylskåp eller frys har jämvikt till rätt temperatur före användning, och detta är särskilt viktigt om du har en relativt kort analystid.
Analysvolym / känslighet
ur ett praktiskt perspektiv bestäms/begränsas analysvolymen av den förbrukningsvara som du använder för dina analyser (t.ex. kyvetter, rör eller mikroplattor). Signalen för de flesta enzymanalyser är proportionell mot analysvolymen och försök att miniatyrisera analysen (t.ex. för att spara reagens) leder vanligtvis till lägre signaler. Absorbansanalyser är emellertid ofta ett undantag, och en övergång från en 3 ml kyvett till 1 ml mikrokuvett, till exempel, kommer inte att ändra absorbansavläsningen om kyvettens bredd (banlängd) fortfarande är 1 cm (dvs. ljuset passerar fortfarande genom samma ’längd’ av vätska). Detta beror på att absorbansen är proportionell mot banlängden, inte till provvolymen.
i mikroplattabsorbansanalyser är banlängden lika med vätskans djup och det är möjligt att miniatyrisera utan signalförlust genom att minska brunnarnas diameter och upprätthålla ett konstant vätskedjup. Till exempel kan 96 brunnsplattor lätt rymma 200ul prov, men med en 50ul analysvolym skulle det vara bättre att använda en 384-brunnsplatta för att öka banlängden över den som ses med 50ul prov i en 96 – brunnsplatta.
kontinuerliga analyser (mätning av produktens utseende över tid)
de flesta analyser utförs under en bestämd tidsperiod (slutpunktsanalyser) och reaktionen stoppas genom tillsats av ett stoppreagens (t.ex. syra). I kontinuerliga analyser registreras emellertid produktens utseende (mindre vanligt konsumtionen av substrat) kontinuerligt (t. ex. med hjälp av en diagraminspelare). Samma grundläggande regler gäller; en plot av signal kontra tid för en fast mängd enzym bör vara linjär och hastigheten bör fördubblas om mängden enzym fördubblas. Så länge analysen drivs i det linjära området kan aktiviteten hos lämpligt utspädda ’okända’ bestämmas exakt från de initiala reaktionshastigheterna uppmätta med en uppsättning standarder.
vilken Substratkoncentration ska jag använda?
koncentrationen av substrat kommer att påverka reaktionshastigheten men det finns flera faktorer att tänka på när man väljer rätt koncentration. Ur praktisk synvinkel är en viktig faktor mängden produkt som måste genereras för att ge en mätbar analyssignal. Eftersom hastigheten för en enzymreaktion sannolikt kommer att falla när mer än cirka 15% av substratet har hydrolyserats, bör den initiala koncentrationen av substrat i allmänhet vara minst 10x koncentrationen av produkt som är känd för att ge en acceptabel analyssignal.
ett annat övervägande är Km för substratet. Medan du lägger till mer substrat betyder det i allmänhet att du kommer att se högre aktivitetsvärden, förhållandet är inte linjärt och kostnaden för substratet kan behöva beaktas. Vid denna tidpunkt är det förmodligen användbart att introducera den klassiska Michaelis-Menten-ekvationen:
v = (Vmax S)/(Km + s) ……………. Eqn. (1)
där v är hastigheten är Vmax den maximala möjliga hastigheten, S är substratkoncentration och Km är lika med substratkoncentrationen som ger halv maximal aktivitet. Härledningen av denna ekvation och dess underliggande antaganden kan hittas i någon textbok om enzymkinetik. Även om det är normalt att mäta snarare än att beräkna graden av enzymreaktioner, är det användbart att förstå de underliggande principerna för analysdesign.
Michaelis-Menten-ekvationen är användbar eftersom den hjälper dig att välja en lämplig koncentration av substrat om Km är känd.
När S = Km, v = (Vmax S)/2s, d.v. s. v/Vmax = S / 2s = kg.
med andra ord kommer enzymet att fungera vid 50% av det maximala möjliga hastigheten när S=Km.
genom att ersätta i ekvation 1 värdena för S = 10 och Km = 1 kommer du att se att genom att öka substratkoncentrationen 10 gånger fungerar enzymet nu vid ~90% av det högsta möjliga hastighet, istället för 50%. Klart detta är högre, men inte 10 gånger högre.
Vid mycket höga koncentrationer av substrat blir Km i ekvation 1 numeriskt obetydlig och den uppmätta hastigheten är då lika med Vmax.
många Analyser körs med substratkoncentration vid eller runt Km-värdet, men om Km är mycket högt kan det inte vara möjligt att använda en så hög koncentration av substrat (t. ex. av kostnadsskäl eller begränsad löslighet).
i vissa situationer kan det till och med vara tillrådligt att använda en relativt låg koncentration av substrat. Till exempel, vid upptäckt av farmaceutiska läkemedel, skulle användningen av mycket höga substratkoncentrationer göra det svårare att identifiera konkurrerande enzymhämmare (konkurrerande hämmare binder till samma ställe som substratet).
en balans mellan de olika faktorerna måste slås så att analysen har en mätbar signal, kan drivas i det linjära området och kan uppfylla alla andra analysmål (t.ex. kostnad, tid och så vidare).
Standardkurvor
en standardkurva krävs alltid om du vill beräkna enzymaktivitet. Det är inte nödvändigt om du bara är intresserad av relativa aktivitetsvärden.
standardkurvan konstrueras genom att mäta analyssignalen med standardlösningar av reaktionsprodukten över ett lämpligt koncentrationsområde. Helst bör du köra en standardkurva för varje experiment, men om standardkurvan är mycket reproducerbar kan det vara acceptabelt att köra den regelbundet.
en typisk standardkurva visas i Figur 2 nedan. Detta är en standardkurva för en ATPas-analys, i vilken ATP hydrolyseras till ADP och Pi (oorganiskt fosfat).
Fig 2. Standardkurva för Pi
fosfatet detekteras med hjälp av ett färgbindningsreagens som ändrar färg i närvaro av fosfat. Specifikationerna för detta test är emellertid inte viktiga här; oavsett produktens natur eller detekteringsmetoden som används, måste en standardkurva som visar signalberoendet på mängden produkt i analysen konstrueras. Kurvan (helst är det en rak linje) används för att bestämma mängden produkt som genereras i prover med okänd aktivitet, dvs från absorbansvärdet, genom att läsa av avlyssningen på x – axeln. (De flesta grafiska programvarupaket beräknar automatiskt värden på x från uppmätta värden på y). Mängden aktivitet kan sedan beräknas (se senare).
plottar jag koncentration eller absolut mängd på X-axeln?
det finns inget enda korrekt svar här, och möjligheten att använda båda metoderna kan ofta orsaka förvirring när aktivitetsvärden beräknas. Till exempel är plottning av nmol av produkt på x-axeln mycket bekvämt om du behöver beräkna aktivitetsvärden (kom ihåg, aktivitet = nmol per min per ml). Laboratoriereagenser framställs emellertid vanligtvis vid kända koncentrationer, och det är ofta lättare att plotta dessa värden på x-axeln. Men när du beräknar aktiviteten (eller specifik aktivitet) av ditt enzym måste du komma ihåg att konvertera koncentrationen på x-axeln till antalet nmol av produkt som bildas, vilket innebär att du måste ta hänsyn till analysvolymen. Anledningen är lätt att förstå: 50ul och 100ul volymer av en standardlösning kommer att ha samma koncentration, men den större volymen kommer att innehålla dubbelt så mycket produkt. I allmänhet är det bäst att välja ett tillvägagångssätt (dvs. antingen plotta absolut mängd produkt eller koncentration) så att samma metod som beräknar aktivitet alltid används.
kontroller och subtraktion av ’tomma’ Data
korrekta kontroller är mycket viktiga för kvantitativt arbete, liksom korrekt användning av kontrolldata i beräkningar.
kontroller berättar (indirekt) hur mycket av analyssignalen beror på enzymets verkan och hur mycket som uppstår av andra skäl. En vanlig källa till ’falsk’ signal är substratet (som ofta kan vara förorenat med produkten). Andra analyskomponenter kan också ge upphov till en liten signal beroende på komponenternas natur och typen av analys. Syftet med kontrollerna är att låta dig ta bort (genom subtraktion) alla delar av den totala signalen som inte är relaterade till enzymets verkan. Om analysen är väl utformad och analysreagensen är av god kvalitet är behandlingen av kontroller vanligtvis ganska enkel.
några allmänna riktlinjer ges nedan:
om vi återgår till den kolorimetriska analysen för att detektera oorganiskt fosfat kan vi markera några potentiella problem som lätt upptäcks med korrekta kontroller.
fosfatdetekteringsreagenset ger en låg avläsning av cirka 0,08 i en 96-brunnsplatta vid våglängden som används för mätning (cirka 650 nm).
Vi kan ställa in följande analyser / kontroller (avläsningar inom parentes i en hypotetisk analyssituation):
- Alla analyskomponenter minus enzym (0.5)
- enzym på egen hand (0.1)
- enzym plus alla andra komponenter (1.8)
det är uppenbart att analyssignalen på 1.8 inte enbart beror på enzymets verkan på substratet.
för varje enzymanalys är en nyckelkontroll (A) att lämna ut enzymet (och ersätta med buffert). Detta ger dig bakgrundssignalen för alla andra analyskomponenter som en grupp, inklusive substratet som kan innehålla en liten mängd produkt. Denna kontroll berättar inte bakgrundssignalen för enzymet, men klart kan du inte lägga till enzymet i substratet som en kontroll! I de flesta analyser ger enzymet ingen signal eftersom det späds ut signifikant före användning i analysen. Detta kan enkelt kontrolleras, som i B ovan.
data för prov A (ovan) tyder på att blandningen är förorenad med oorganiskt fosfat. De enskilda komponenterna kan sedan kontrolleras för att identifiera källan till problemet. Denna situation är ganska vanlig för analyser av Atpaser och andra fosfatgenererande enzymer, eftersom substraten ofta är instabila och delvis hydrolyseras för att ge lite oorganiskt fosfat.
det kan vara besvärligt att korrigera rådata om flera komponenter ger falska signaler; eliminering av problemet vid källan är i allmänhet mycket bättre än någon matematisk behandling. Det korrigerade värdet för prov c ovan kan tyckas vara 1,2 (dvs. 1.8 – 0.5 – 0.1) men strängt taget är detta fel. Kom ihåg att analysplattan plus detektionsreagens ger en bakgrundssignal på cirka 0,08, så källan till det mesta av signalen för kontroll A är plasten på plattan och/eller detektionsreagensen. Samma lilla signal måste också döljas inom värdet för enzymkontrollen. Således har vi i korrigeringen som tillämpas ovan subtraherat detta dolda ämne två gånger.
Du måste alltid subtrahera kontroller från analysdata, och det är att föredra att kombinera alla ämnen (utom enzym) och subtrahera ett enda värde. Om detta tillvägagångssätt tas, behandlas standardkurvan på samma sätt och ett kontrollvärde subtraheras (dvs. värdet erhållet i frånvaro av produkt, dvs. analogt med plattan/reagensämnet som diskuterats ovan). Således innehåller varken den subtraherade analysdata eller den subtraherade standardkurvan den potentiellt vilseledande bakgrundssignalen som orsakas av plattan/analysreagensen.
slutligen, som vi har sett, upptäcks falska signaler lätt med korrekta kontroller, men den bästa strategin för att få data av god kvalitet är att använda reagenser med låg bakgrund så att kontrollvärdena är låga. Det är också användbart att generera en analyssignal (på grund av enzym) som är mycket högre än någon bakgrundssignal. Helst bör signal-till-bakgrundsförhållandet vara minst 5 och helst 10 eller mer för exakt kvantitativt arbete.
beräkning av Aktivitetsvärden
det här är ganska lätt att förstå om vi back-beräknar från råanalysdata på stegvis sätt. Låt oss till exempel säga att vi har genererat 10nmol produkt i vår enzymreaktion (dvs bestämd från standardkurvan för signal kontra absolut mängd produkt). Eftersom aktivitet uttrycks som nmol per min per ml, måste vi överväga tid och volym och, kanske mindre uppenbart, mängden och utspädningen av enzym för att beräkna aktivitet.
om analysen är 10 min lång är antalet nmol per min i exemplet ovan 1. (steg 1)
om analysvolymen är 200ul måste vi multiplicera med 5 (dvs 1000/200) för att få nmol per min per ml. (steg 2)
detta värde avser enzymets aktivitet i analysen, inte i provet av enzym som används för att ställa in analysen. Några ytterligare korrigeringsfaktorer behövs för att bestämma enzymaktiviteten i det ursprungliga provet av enzym.
enzymet kan ha utspätt före användning, och det måste spädas ytterligare med de andra komponenterna som finns i analysen. Om analysen (200ul totalt) innefattar 20ul enzym och enzymet förspäds 1/100 innan 20ul-provet tillsätts kan du förmodligen se att vi först ska multiplicera med 10 (steg 3) och sedan med 100 (steg 4) för att få enzymets aktivitet i den ursprungliga enzymlösningen.
hittills är det relativt enkelt. Vi nämnde emellertid tidigare att koncentrationen ofta plottas på x-axeln i standardkurvan. Således kan värdena uttryckas i mM-termer (inte mmol) och du kan inte bestämma antalet mmol helt enkelt genom att inspektera standardkurvan.
eftersom mM betyder mmol per liter, har vi en skillnad mellan den underförstådda volymen 1L och den faktiska analysvolymen. Således om vi har 10 mm produkt och analysvolymen är 200ul, måste vi dela med 5000 för att få antalet mmol av produkten.
Du kanske märker här att delning med 5000 här kompenserar några av de multiplikationsoperationer som krävdes ovan. Det är faktiskt ganska normalt att korrigeringsfaktorer avbryter. Till exempel, i en 10 minuters analys med 1/10 utspätt enzym, kommer du att dela med 10 för att få nmol per min och multiplicera med 10 senare för att korrigera för utspädningsfaktorn.
det följer att om du alltid använder standardanalysförhållanden (dvs. din standard), kommer du att kunna multiplicera ’x’ – värdet från standardkurvan med en enda global korrigeringsfaktor, som omfattar alla andra individuella korrigeringsfaktorer, för att beräkna dina aktivitetsvärden. Endast vid första tillfället behöver du identifiera de enskilda korrigeringsfaktorerna.
Enzymhämning / läkemedelsscreening
detta är ett område för enzymologi där det fortfarande finns ett behov av att arbeta i det linjära området men där beräkningar av aktivitetsvärden vanligtvis inte är relevanta; snarare är den relativa reaktionshastigheten (eller den relativa mängden produkt som bildas) i närvaro och frånvaro av ett testämne nyckeln, vilket kräver lite mer än enkla beräkningar med hjälp av de blanka subtraherade analysdata. Efter subtraktion av ämnena uttrycks mängden bildad produkt som en procentandel av den mängd som erhållits i frånvaro av testämnet (dvs. 100%). Dessa analyser kan ibland köras med ganska låga signal-till-bakgrundsförhållanden, eftersom frågan ställs-hämmar testämnet reaktionen?
– kräver bara ett ja / nej svar.
sammanfattning
denna guide har förhoppningsvis gett tydliga förklaringar av ’enzymenheter’, ’enzymaktivitet ’ och’ specifik enzymaktivitet’, och enhetsdefinitioner och betydelsen av’linjärt intervall’. Specifikationerna för vad man ska plotta på x-axeln för standardkurvor är en fråga om användarpreferens men viss försiktighet krävs när aktiviteter beräknas. Analyskontroller är viktiga men att använda högkvalitativa reagenser är bättre än att ta bort bakgrunder med matematiska metoder. En hög signal till bakgrundsförhållande är önskvärt för kvantitativt arbete och ett antal parametrar kan varieras för att öka analyssignalen; det är inte alltid nödvändigt att bara lägga till mer enzym. Enzymaktivitetsvärden kan enkelt beräknas om ett stegvis tillvägagångssätt används för att identifiera nyckelanalysvariablerna.
Se fler protokoll och guider