identifiering av Bordetella pertussis hos en kritiskt sjuk Human Immunbristvirusinfekterad Patient genom direkt genotypisk analys av Gramfärgat Material och diskriminering från B. holmesii genom att använda ett unikt RecA-Genbegränsningsenzymställe

identifiering av bakterier från kliniska prover görs till stor del via fenotypisk karakterisering efter in vitro-odling och mikroskopi. Inte ovanligt avslöjar emellertid direkta Gramfärgade preparat många organismer, men kulturer misslyckas med att visa en patogen. Detta illustrerades i ett nyligen kliniskt fall, där en 48-årig man med AIDS togs in med lung coccidioidomycosis. Trots antimykotisk behandling kunde hans status inte förbättras. Sputumprover avslöjade många gramnegativa baciller på direkt mikroskopi men inga patogener på kultur. Dessutom växte flera blodkulturer snabba gramnegativa stavar, som inte kunde specieras med konventionella metoder.

vi bestämde oss för att försöka identifiera de två isolaten genom genotypiska metoder med användning av universella oligonukleotidprimrar riktade mot den lilla subenheten rRNA (16S rRNA) – genen. Från andningsproverna var emellertid endast Gramfärgade bilder tillgängliga. Vi utvecklade därför en ny metod, där bakteriellt DNA återvinns direkt från den Gramfärgade bilden. Slides Gram färgades av traditionell metod (12). En klar Glasskiva smordes med prover och behandlades med absolut metanol (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), följt av värmefixering vid 65 kcal C och behandling med kristallviolett lösning (Remel, Lenexa, Kans.). Bilden behandlades vidare med Gram jod (Remel), avfärgades med alkohol-acetonlösning (3:1) och motfärgades med safranin (Remel). Nedsänkningsolja avlägsnades först från bilden med 100% xylen (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) följt av sköljning i 100% etanol. Därefter skrotades materialet med ett rakknivblad, suspenderat i 50 millil Puregene-DNA hydratiseringslösning (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexed och kokt i 10 min. För analys av blodisolatet användes material från både BACTEC-flaskan och från kolonier odlade på fast medium. Efterföljande PCR utfördes i en volym av 50 oktyl innehållande 5 oktyl av mallen, 1,5 mM MgCl2, 100 oktylm varje deoxynukleosidtrifosfat (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U av Taq DNA-polymeras (Roche Diagnostics Corporation), och 0.15 occrimm (vardera) universella 16S rRNA primers 11e (5′-GAGGAAGGTGGGGGATGACG-3′) och 13b (5′-TCCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′) såsom beskrivits tidigare (15). Efter ett denatureringssteg på 5 min vid 94 kg C upprepades PCR-steg på 94 kg C för 60 sekunder, 50 kg C för 60 sekunder och 72 kg C för 90 sekunder 30 gånger i ett Perkin-Elmer GeneAmp PCR-system 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Produkter erhölls från både sputum och blod (Fig. 1). Dessa renades med QIAquick PCR-reningssatsen (Qiagen Inc., Valencia, Kalifornien.), och DNA-sekvensering utfördes på en tillämpad Biosystems ABI3100 sequencer (HHMI Biopolymer/WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine). Efterföljande jämförelse med den offentliga databasen (GenBank) av BLAST (1) identifierade blodisolatet som Helicobacter cinaedi eller Helicobacter rappini. Båda organismerna har associerats med bakteriemier hos patienter med nedsatt immunförsvar(9, 10, 13, 16, 17). PCR-produkten från andningsisolatet matchade 16S rRNA-generna av både Bordetella pertussis och Bordetella holmesii, vilka är 99,5% homologa och identiska i den förstärkta regionen (18).

För att speciera Bordetella respiratoriskt isolat och för att validera resultatet av den genotypiska analysen utvecklades en diskriminerande analys där en del av recA-genen (6, 7), som innehåller ett unikt restriktionsenzymställe, riktades. Förstärkning av B. pertussis (ATCC 9340; amerikansk typ Kultursamling, Manassas, Va.) och B. holmesii (ATCC 51541) DNA såväl som det från vår patients sputumgramfärgning utfördes som beskrivits ovan, förutom att 3 mM MgCl2 och nydesignade specifika primers (framåt, 5 ’- CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; och omvänd, 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3’) användes, och PCR steg (94 C för 30 s, 59 C för 30 s, och 72 C för 60 s) upprepades 45 gånger följt av en slutlig töjning steg vid 72 C. produkter smältes med NciI enligt tillverkarens rekommendationer (New England Biolabs, Inc. Beverly, Massa.). De två organismerna kunde lätt särskiljas eftersom B. holmesii har två ncii-platser, medan B. pertussis och alla andra Bordetella spp. har bara en ncii-plats inom den förstärkta regionen. Sputumisolatet identifierades därefter som B. pertussis (Fig. 2) och har rapporterats som en opportunistisk lungpatogener hos humana immunbristvirusinfekterade patienter (4, 5).vi undersökte därefter om den genotypiska identifieringen av organismer direkt från kliniska Gram-fläckpreparat med universella primers är en genomförbar och reproducerbar metod. Typen av fixering (värme, 100% metanol och 100% etanol) och närvaron av färgrester efter Gramfärgning som beskrivits ovan stör inte PCR. En detektionsgräns på 1,500 CFU/xnumx xnumx sputum (6 till 30 organismer per oljefält) hittades, vilket liknar andra rapporter (14). För detta resultat poolades tre slumpmässiga kliniska sputumprover utan bakterier på Gram-fläck eller i odling, spikades med definierade mängder Escherichia coli (ATCC 25922), fixerade och Gram färgade och skrapades av bilden som beskrivits ovan. Flera slumpmässigt utvalda kliniska prover testades, och när en dominerande organism var synlig på mikroskopi matchade dess identifiering den odlade patogenen (Tabell 1).

vår metod har flera fördelar jämfört med tidigare beskrivna analyser. Till skillnad från tidigare rapporter, där DNA först extraheras från sputum och artspecifika primers används (2, 11, 14, 19, 20), vår analys använder DNA som återvinns direkt från Gramfärgade bilder utan extraktionssteg och använder universella primers, vilket möjliggör identifiering av ett brett spektrum av bakterier med ett enkelt protokoll. Som visat kan detta uppnås även i närvaro av normal bakgrundsboende flora eftersom antalet PCR-cykler är begränsat, vilket möjliggör konkurrenskraftig amplifiering av bakteriellt DNA. Eftersom kvaliteten på det inlämnade provet och de relativa proportionerna av morfologiskt olika mikrober lätt kan bestämmas på Gramfläckar kan lämpliga utstryk väljas före DNA-amplifiering. Dessutom tjänar Gramfläckutseendet hos den dominerande organismen som en intern kvalitetskontroll efter genotypisk identifiering. Som med fenotypisk identifiering måste resultaten av vår analys korreleras med den kliniska bilden innan behandlingsbeslut fattas, eftersom ingen av metoderna på ett tillförlitligt sätt kan skilja mellan kolonisering och infektion.

bland de få rapporterna i den engelska språklitteraturen som beskriver återvinning av nukleinsyra från kliniska prover på glasskivor (3, 8) har ingen hittills beskrivit DNA-amplifiering efter återvinning av bakterier från Gramfärgade bilder. Vår metod är snabb och pålitlig och kan användas som ett verktyg i fall där organismer ses i överflöd på kliniska Gramfärgade bilder, men inte kan återvinnas i kultur. Tekniken kan vara särskilt användbar när en diagnos söks retroaktivt eller efter att de ursprungliga proverna har kasserats.

• upphovsrätt 2004 amerikanska samhället för mikrobiologi