identifiering av dämpning och antitermineringsreglering i prokaryoter

karakterisering av dämpare I B. subtilis och E. coli

en omfattande litteratursökning för operoner I B. subtilis reglerad genom dämpning eller antitermination utfördes och 46 sådana operoner hittades. Dessa sträcker sig från den experimentellt väl beskrivna trp-operonen till de operoner där terminatorstrukturer har hittats och dämpning förväntas men inte väl karakteriseras experimentellt (för en fullständig lista se http://www.bork.embl-heidelberg.de/Docu/attenuation). Dessa 46 kända terminatorstrukturer användes för att bestämma gemensamma egenskaper hos B. subtilis dämpningsterminatorer. Med hjälp av dessa egenskaper screenade vi uppströmsregioner av 3650 B. subtilis-gener (med procedurer som beskrivs i material och metoder) för terminatorveck. Fyrtiotre av originalet 46 kända terminatorer som hittades i litteratursökningen behölls i denna screening. Ytterligare 1117 uppströms veck som passar våra kriterier erhölls också. Dessutom använde vi som en kontroll samma filtrerings-och vikningsmetodik på intergena regioner efter att sekvenserna blandades slumpmässigt (952 veck av slumpmässigt blandade sekvenser erhölls efter filtrering).

de resulterande vikarna av alla intergena regioner och blandade sekvenser erhållna efter filtrering plottades med avseende på deras stabilitet och längd (Figur 1). De kända terminatorveckarna ligger i ett kluster som är tydligt separata och skiljer sig från de veck av slumpmässigt blandade sekvenser. Terminatorveck har en mindre fri energi (USC) i förhållande till Längd än förutsagda veck av slumpmässiga sekvenser. Ett liknande mönster av två lätt separerade kluster framträder när man jämför kända terminatorstrukturer med vikta intragena regioner där terminator inte förväntas hittas (data visas inte).

med hjälp av huvudkomponentanalys bestämde vi den största variansen av de slumpmässigt blandade sekvenserna. Detta kan ge oss ett mått (med standardavvikelse) av vilka veck skiljer sig avsevärt från veck av slumpmässiga sekvenser (se material och metoder). Av de 1160 vikarna faller totalt 203 vikningar av intergena regioner som erhållits i vår skärm under den 2: a avvikelselinjen (z 0B -2) härledd från huvudkomponenten. Dessa anses således väsentligt skilja sig från slumpmässiga veck och möjliga avslutningsställen för dämpning eller antitermineringsreglering. Fyrtiotvå av dessa är de kända dämpningsterminatorerna (av de ursprungliga 43 kända veck som upprätthålls efter filtrering). Således kan vi få 91.3% (42 / 46) av de kända och experimentellt karakteriserade dämpnings-och antitermineringsställena med vårt filter och signifikansmått. Dessutom skärmar filtret och signifikansmätningen ut över 97,7% (930 av 952) av vikarna i slumpmässiga sekvenser. Etthundrasextioen (203 totalt exklusive 42 kända) veck under linjen (z 6UC -2) är veck som ännu inte analyserats experimentellt och kan förutsägas vara dämpningsterminatorstrukturer.

en detaljerad undersökning fann att många av dessa förutsägelser starkt stöds som en förmodad dämpning eller antitermineringsställen genom genomiskt sammanhang, såsom närvaron av förmodade promotorsekvenser, uppströms placering av förmodade och kända operoner, etc. Två terminatorstrukturer uppströmsgener ydbJ och yqhI tjänar som detaljerade exempel på hur genomiskt sammanhang kan informera och starkt stödja förutsägelserna i Tabell 1 (Figur 2). Gen ydbJ av B. subtilis är listad som hypotetisk med homologi till en ABC-transportörgen (ATP-bindande protein involverat i koppartransport). Genen omedelbart nedströms, ydbK, har homologi till membran som spänner över permeaser. Med hjälp av sträng (ett sökverktyg för att hitta återkommande instanser av angränsande gener) finns orthologer av dessa två gener också i samma ordning i transkriptionsenheter av 15 andra avlägset relaterade genom, vilket tyder på möjligheten att dessa gener bildar en operon. Dessa gener verkar vara i en typisk ABC-transportöroperonkonfiguration och flera ABC-transportöroperoner är kända för att regleras genom dämpning i B. subtilis . Ydbj uppströmsregionen har också en förmodad promotorsekvens och förutsagda veck med RNAfold (se material och metoder) för hela uppströmssekvensen föreslår att den kan vikas i komplexa möjliga antitermineringsveck (data visas inte). Baserat på detta sammanhang förutspår vi att detta är en ABC-transportöroperon reglerad av dämpning. Det andra exemplet, yqhI, är den första genen av en körning av tre gener som alla har homologi till glycinbiosyntesgener i en förmodad transkriptionsenhet. Denna körning av tre gener har också ortologer som finns som grannar i andra genom . Många aminosyrabiosyntesoperoner I B. subtilis är kända för att regleras genom dämpning, vilket stöder denna förutsägelse.

För att se om de observerade mönstren håller för det enda andra genomet där dämpning eller antitermination är väl studerat och experimentellt beskrivet, tillämpade vi också samma metod för uppströms regioner av gener i E. coli-genomet för vilka 16 operoner har beskrivits som reglerade genom dämpning eller antitermination. Som kan ses i Figur 3 har de kända E. coli-dämpnings-och antitermineringsterminatorstrukturerna liknande egenskaper som B. subtilis. 15 av de 16 kända dämparna bibehölls efter filtrering. Signifikansmåttet separerar 14 av dessa E. coli-terminatorer från slumpmässiga veck som ses i Figur 3. Som I B. subtilis, med hjälp av linjen (z-2) som ett mått på betydelse, kan vi förutsäga dämpning för 146 regioner (Figur 3 och Tabell 2).

utvidgning av analys till 26 genom

analys av B. subtilis och E. coli föreslår att en bredare undersökning av bakteriegenom kan visa sig vara användbar i både förutsägelsen av dämpning och antitermineringsreglering i dessa genom och karakteriseringen av utvecklingen och fördelningen av dessa regleringsmekanismer. Tjugofyra avslutade genom valdes för denna undersökning baserat på deras breda fördelning över det evolutionära spektrumet (tabell 3). De intergena regionerna i vart och ett av dessa genom analyserades med samma metoder och filter som med B. subtilis och E. coli och förutsagd dämpning och antitermination terminator veck på liknande sätt erhållits.

som visas i tabell 3 finns det en bred fördelning av antalet förmodade dämpnings-och antitermineringsregleringsställen i de undersökta genomerna. Dessa sträcker sig från 5 i Mycobacterium tuberculosis till 275 i Clostridium acetobutylicum (tabell 3). Tidigare försök att förutsäga standardavslutningsställen för transkription i slutet av transkriptionsenheter ger liknande resultat. Intressant är att resultaten för standardtranskriptionsterminatorer korrelerar med våra. Som hittades i Ermolaeva et. al med standardterminatorer i slutet av transkriptionsenheter (detta papper studerade terminatorer vid slutet av ORFs och riktade sig inte uppströms regioner, vilket filtrerade bort möjliga dämpare), några av de högsta antalet förekomster av dämpnings-och antitermineringsställen i vår undersökning finns på liknande sätt i genomerna av E. coli, H. influenze, D. radioduraner och B. subtilis och det lägsta antalet förekomster i sådana genom som H. pylori och M. tuberculosis (genom rapporterade i deras undersökning).

Vid första anblicken verkar detta tyder på att många Genom inte använder samma mekanismer för uppsägning för standardtranskriptionsavslutningen och inte använder dämpning eller antiterminering i reglering. Detta är sannolikt fallet i vissa genomer. Ändå, om antalet uppströms intergena regioner plottas mot antalet förutsagda platser, visas en stark positiv korrelation (Figur 4). Ju mindre antalet gener och intergena regioner ett Genom har, desto lägre är förekomsten av förutsagda terminatorer (både standardtranskriptionsterminatorer och dämpnings – /antitermineringsreglerande terminatorer). Detta indikerar att det låga antalet både standardavslutning och reglerande uppsägning i många genom beror på en mycket reducerad genomstorlek och minskningen av antalet reglerande operoner, och inte nödvändigtvis beroende av olika mekanismer för uppsägning och reglering.

det finns en tydlig outlier med ett mycket lägre än förväntat antal förmodade terminatorer som ses i Figur 4, Mycobacterium tuberculosis. Detta genom har en mycket lägre förekomst av förmodade dämpnings-och antitermineringsställen än vad som skulle föreslås av dess storlek och antalet intergena regioner. Ett nyligen publicerat papper av Unniraman et al. drar slutsatsen att M. tuberculosis använder en annan terminationsmekanism som använder terminatorstrukturer utan poly-U-svansen som är nödvändig i andra genom. Således kan det reducerade antalet Poly-U-innehållande terminatorstrukturer i förhållande till antalet intergena regioner förklaras av M. tuberculosis beroende av en annan uppsägningsmekanism. Detta bevisar inte nödvändigtvis att det inte finns någon dämpning eller reglering av antitermineringstyp vid M. tuberculosis. Det indikerar emellertid att antingen förlusten av standardmekanismen för uppsägning i detta genom har minskat om inte eliminerat dämpning eller antitermination i M. tuberculosis eller alternativt kan en dämpningsliknande mekanism existera i detta genom som utnyttjar M. tuberkulos icke-standard terminator.

alla andra av de 25 undersökta genomerna har förmodade dämpnings-eller antitermineringsregleringsställen. Även det lägsta antalet förutspådda dämpnings-eller antitermineringsställen som finns i M. genitalium är en betydande del av möjliga reglerande intergena regioner, det låga antalet förklaras lätt av detta genoms relativt lilla storlek och få intergena regioner och transkriptionsenheter. Dessa resultat tyder på att dämpnings-och antitermineringsreglering är en eventuellt allestädes närvarande regleringsmekanism i prokaryoter med få undantag.

Genomstorlek och dämpning

om GC-innehållet i ett genom jämförs med antalet förutsagda dämpare baserat på slumpmässigt blandad sekvens, korrelerar GC-innehållet något med antalet förutsagda dämpare, vilket kan förväntas eftersom en poly-U-körning krävs i filtren. I Figur 5a plottades veck från slumpmässigt blandade intergena sekvenser av våra 26 Genom av antalet filtrerade veck per intergen region i förhållande till antalet intergena regioner. Om antalet filtrerade veck var helt slumpmässigt bör det finnas ett relativt konstant antal platser per region i förhållande till antalet regioner. Som framgår av figur 5a är detta inte helt fallet. Antalet filtrerade veck per region erhållen från slumpmässigt blandade sekvenser är beroende av GC-innehållet i genomet. Genom med lågt GC-innehåll har ett något högre antal veck per region än genom med cirka 50% GC-innehåll och genom med högt GC-innehåll har mycket lägre antal än båda. Detta förväntas från slumpmässiga sekvenser filtreras för stam-loop strukturer som innehåller poly-U körningar.

även med hänsyn till GC-innehållet i M. tuberculosis har det ett minskat antal förutsagda dämpare i förhållande till de andra hög-GC-genomerna (figur 5b). I själva verket visar figur 5b (förutsagda dämpare av faktiska intergena sekvenser) att det starkaste bestämningen av antalet förutsagda dämpare per intergen region inte är GC-innehåll utan snarare genomstorlek (mer specifikt antalet intergena regioner). I allmänhet har inte bara större genom ett större absolut antal förutsagda dämpare, men har en större förekomst av förutsagda dämpare per region. Om GC-innehållet är lika i två Genom, är det större genomet mer sannolikt att ha ett högre antal förutsagda dämpare per intergen region. Tidigare rapporter har föreslagit liknande fenomen i regulatoriska proteiner, Stora genom verkar ha en större andel av deras totala antal gener som kodar för proteiner som innehåller regulatoriska motiv . Intressant, diskontering av archaebakterier och genom med högt GC-innehåll, verkar ett Genom av cirka 1500 intergena regioner vara tröskeln där frekvensen av reglerande dämpare ökar i ett genom.

Distribution och bevarande av dämpare i grampositiva bakterier

sju genom av grampositiva bakterier (B. subtilis, B. halodurans, L. innocua, S. aureus, C. acetobutylicum, L. lactis och S. pneumoniae) analyserades för att se om dämpningsterminatorerna bevaras framför orthologerna. Antalet förutsagda dämpningsterminatorer för generna som är kända för att regleras i B. subtilis och deras ortologer i de andra sex genomerna listas i Tabell 4. Genomerna sorteras efter fylogenetiskt avstånd från B. subtilis beräknas med aminosyrasekvenser av de delade orthologerna bland dessa genom. Den närmaste till B. subtilis är B. haloduraner och det genomsnittliga antalet aminosyrasubstitutioner per plats är 0,238, och den mest avlägsna är S. pneumoniae och det genomsnittliga antalet aminosyrasubstitutioner per plats är 0,422. För de 42 gener som anges i Tabell 4 varierar antalet ortologer som finns i de andra genomerna lite från Genom till genom: det högsta och det lägsta antalet ortologer är 31 i L. lactis respektive 26 i S. aureus respektive C. acetobutylicum. Detta beror främst på att dessa 42 gener har några grundläggande funktioner såsom aminoacyl-tRNA-syntes. Å andra sidan varierar antalet förutsagda dämpningsavslutningsstrukturer avsevärt: i B. haloduraner, 22 orthologa gener har förutspått dämpningstermineringsstrukturer, medan endast 4 orthologa gener har de förutsagda strukturerna i S. pneumoniae. Detta indikerar att frånvaron eller närvaron av reglering genom dämpning är mycket svagare bevarad än genen eller operonernas närvaro.

samma trend gäller för de förutspådda dämpningsavslutningsstrukturerna än kända (Tabell 5). Det finns 105 orthologous gengrupper som har åtminstone en annan genom som innehåller en förutsagd dämpare struktur uppströms en orthologous gen. Begränsning till ortologerna som har förutsagt dämpare I B. subtilis (35 grupper), Det högsta och det lägsta antalet delade orthologer av gener som är kända för att regleras genom dämpning eller antitermination I B. subtilis är 28 (L. innocua) respektive 18 (S. pneumoniae). Antalet förutsagda dämpningsavslutningsstrukturer varierar dock mer. Medan det finns 13 gener med förutsagda strukturer i B. halodurans, som är den närmaste arten till B. subtilis bland de sex grampositiva bakterierna, har endast 2 gener förutsagt strukturer i S. pneumoniae.

även om det finns svag bevarande av dämpare som helhet, förutsagda dämpningsavslutningsstrukturer och ordningen på deras nedströmsgener bevaras för vissa grupper av gener. Ett sådant exempel är infC-rpml-rplT operon (figur 6a). Ingen dämpningsavslutningsstruktur förutses i uppströmsregionen av infC i S. pneumoniae (Tabell 5). Närmare titt på denna region av BLAST avslöjade att n-terminalen för infC är över förutsagd i 27 baser. Genom att lägga till de 27 baserna till den intergena regionen i uppströms fann vi en stabil stam-loop-struktur som följde av poly-U-rester också i S. pneumoniae (figur 6b). Även i detta exempel finns det dock betydande skillnader mellan arter i den relativa positionen för stam-loop-strukturerna och sekvensbevarande. Dessutom, även mellan det fylogenetiskt närmaste paret, B. subtilis och B. haloduraner, avstånden från slutet av stammen till startkodonet för infC är 69 respektive 37 baser, och endast de vanliga segmenten som finns i stammen är GUGUGGGN{x}CCCACAC (x = 12 I B. subtilis och x = 9 i B. haloduraner). Bland alla de sju genomerna finns det bara en svag likhet, GUGGG (GACGG i C. acetobutylicum) i stamregionen.

bevarande av förutsagda dämpningsavslutningsstrukturer observeras också i uppströmsregionerna för den möjliga operoninnehållande Nusa-genen (figur 7a). Fyra av sju genom innehåller förutsagda dämparstrukturer i uppströms det hypotetiska proteinet (ylxS I B. subtilis). Stam-loop-strukturer finns också i resten av tre Genom, även om dessa strukturer inte passerar filtren. Placeringen av strukturerna till transkriptionsstartplatsen för nedströmsgenen och sekvenserna varierar också signifikant i detta exempel. I dessa stamsekvenser bevaras segmentet GUGGG (GAGCG i L. lactis och GAGGC i S. pneumoniae) i den förutsagda operoninnehållande Nusa-genen (figur 7b). Intressant är att 5-bassegmenten är identiska eller mycket lik segmenten i stam-loop-strukturerna belägna i uppströms infC (figur 6b). Proteinerna som kodas generna i dessa två operon är involverade i transkription. Bevarandet av sekvenssegmenten i de förutsagda dämpningsterminatorstrukturerna för infC-rpmI-rplT operon och operon som innehåller nusA innebär att det finns en gemensam regleringsmekanism som känner igen stam-loop-strukturen och detta skulle reglera båda operonerna på samma sätt.

Distribution och bevarande av dämpare i Proteobakterier

flera aspekter av bevarande av dämpare framgår omedelbart av vår analys av grampositiva bakterier . För det första är fördelningen av dämpnings-eller antitermineringsreglering inte väl bevarad över gram-postiv baceria och dessutom, även i konserverade regleringssystem, är sekvens-och strukturbevarande svag. Detsamma gäller för Proteobakterier. Av 14 gener i E. coli (Se tabell 5a) känd för att regleras genom dämpning eller antitermination, ingen har dämpare förutspådde uppströms orthologs i alla de fyra andra proteobacteria genomerna. Sex har dämpare förutspådde uppströms orthologs i åtminstone en av de andra fyra genomerna. Tre är gener som har ortologer i alla fyra andra genom, men dessa har inga förutsagda dämpare. De återstående fem generna i E. coli har antingen inga kända ortologer i det andra genomet eller ortologer har en fläckig fördelning och inga förutsagda dämpare. Närmare inspektion för hand bekräftar denna slutsats. Tabell 5b är en lista över alla förutsagda dämpare i vart och ett av de fem genomerna i gamma-uppdelningen av Proteobakterier där en liknande dämpare förutses för en ortolog av ett annat genom. Som visas i denna tabell verkar dämpning och antitermination vara dåligt bevarad som en regleringsmekanism i Analoga operoner i proteobakteriella genom. Av totalt 475 gener och deras orthologer i dessa fem genom som har förutsagt dämpare delas endast 36 uppströms orthologer av två eller flera genom (tabeller 3, 5A och 5b).

tidigare forskning om specifika system har rapporterat att dämpning och antitermineringsreglering i vissa operoner i E. coli endast är mildt bevarade över gamma Division Proteobakterier. Förordningen rpsJ operon och trpE och pheA operoner av E. coli har visat sig ha en prickig fördelning och svagt konserverad över Proteobakterier. Som visas i tabellerna 2, 5a och 5b har vi kunnat utvidga denna analys av dämpning och antitermination till de flesta sådana system i Proteobakterier och har visat att detta gäller för alla kända dämpnings-och antitermineringsreglerande mekanismer i E. coli och andra förutsagda mekanismer i ytterligare gamma division genom. Ett exempel ges i Figur 8 av låg sekvens bevarande av dämpare och reglering. I figur 8a visas en av de mer konserverade dämparna för hisG operon. Denna operon-och regleringsmekanism kännetecknas väl av E. coli och vår analys förutsäger liknande mekanismer för dämpningsreglering i V. cholerae och H. influenzae. De förutsagda dämparna har bevarat position (vid ungefär 40-50 bp uppströms startkodon av hisG-genen) och stamsekvens. Även om de omgivande intergena regionerna inte är möjliga att anpassa, V. cholerae och H. influenzae har möjliga aminosyraledarsekvenser med en körning av histidiner som är karakteristisk för dämpningsregleringsmekanismen i E. coli. Förutspådda dämpare hittades inte i de andra tre gamma-indelningsprobacteria-genomerna av P. aeruginosa, N. meningitidus och X. fastidiosa. I P. aeruginosa är den intergena regionen uppströms hisG ortholog endast 17 bp i längd, i X. fastidious överlappar den ortologa genen med ORF uppströms, och även om den analoga N. meningitidus intergena regionen är av tillräcklig längd, ingen dämpare förutses.