på 1970-talet utfördes mest vätskekromatografi med användning av en fast stöd stationär fas (även kallad en kolonn) innehållande omodifierad kiseldioxid eller aluminiumoxidhartser. Denna typ av teknik kallas nu normalfas kromatografi. Eftersom den stationära fasen är hydrofil i denna teknik kommer molekyler med hydrofila egenskaper som ingår i den mobila fasen att ha en hög affinitet för den stationära fasen och kommer därför att adsorbera till kolonnpackningen. Hydrofoba molekyler upplever mindre affinitet för kolonnpackningen och kommer att passera för att elueras och detekteras först. Eluering av de hydrofila molekylerna adsorberade till kolonnförpackningen kräver användning av mer hydrofila eller fler polära lösningsmedel i mobilfasen för att flytta fördelningen av partiklarna i den stationära fasen mot den mobila fasen.
omvänd fas kromatografi är en teknik som använder alkylkedjor kovalent bundna till de stationära faspartiklarna för att skapa en hydrofob stationär fas, som har en starkare affinitet för hydrofoba eller mindre polära föreningar. Användningen av en hydrofob stationär fas är i huvudsak motsatsen till normal faskromatografi, eftersom polariteten hos de mobila och stationära faserna har inverterats – därav termen omvänd fas kromatografi. Omvänd fas kromatografi använder en polär (vattenhaltig) mobil fas. Som ett resultat tenderar hydrofoba molekyler i den polära mobilfasen att adsorbera till den hydrofoba stationära fasen, och hydrofila molekyler i mobilfasen kommer att passera genom kolonnen och elueras först. Hydrofoba molekyler kan elueras från kolonnen genom att minska polariteten hos den mobila fasen med hjälp av ett organiskt (icke-polärt) lösningsmedel, vilket minskar hydrofoba interaktioner. Ju mer hydrofob molekylen desto starkare kommer den att binda till den stationära fasen och ju högre koncentrationen av organiskt lösningsmedel som kommer att krävas för att eluera molekylen.
många av de matematiska och experimentella överväganden som används i andra kromatografiska metoder gäller också för RPC (till exempel är separationsupplösningen beroende av kolonnens längd). Det kan användas för separation av en mängd olika molekyler. Det används vanligtvis inte för separation av proteiner, eftersom de organiska lösningsmedlen som används i RPC kan denaturera många proteiner. Av denna anledning, normal fas kromatografi används oftare för separation av proteiner. Denatureringen av proteiner kan emellertid faktiskt vara fördelaktig vid den senare analysen av proverna erhållna från kromatografin. Om en enzymatisk matsmältning med trypsin utförs på de analyserade proteinerna är linjärt protein mer lämpligt för detta. Därför kan denatureringen av proteiner med användning av lämpliga lösningsmedel som orsakar utvecklingen av proteinerna faktiskt vara avsiktlig innan man tar det fraktionerade provet genom masspektrometri.
idag är RPC en ofta använd analytisk teknik. Det finns en mängd stationära faser tillgängliga för användning i RPC, vilket möjliggör stor flexibilitet i utvecklingen av separationsmetoder.
kiseldioxidbaserad stationär fasedit
varje inert polärt ämne som uppnår tillräcklig förpackning kan användas för omvänd fas kromatografi. Den mest populära kolonnen är en oktadecylkolkedja (C18)-bunden kiseldioxid (USP-klassificering L1). Detta följs av C8-bunden kiseldioxid (L7), ren kiseldioxid (L3), cyano-bunden kiseldioxid (L10) och fenylbunden kiseldioxid (L11). Observera att C18, C8 och fenyl är dedikerade reverserade fashartser, medan cyanokolonner kan användas i omvänd fasläge beroende på analyt och mobila fasförhållanden. Inte alla C18-kolumner har identiska retentionsegenskaper. Ytfunktionalisering av kiseldioxid kan utföras i en monomer eller en polymerreaktion med olika kortkedjiga organosilaner som används i ett andra steg för att täcka återstående silanolgrupper (slutkapning). Medan den totala retentionsmekanismen förblir densamma, kommer subtila skillnader i ytkemikerna i olika stationära faser att leda till förändringar i selektivitet.
moderna kolumner har olika polaritet. PFP är pentafluorfenyl. CN är cyano. NH2 är amino. ODS är oktadecyl eller C18. ODCN är en blandad lägeskolonn bestående av C18 och nitril. SCX är stark katjonisk utbyte (används för separation av organiska aminer). SAX är stark anjonisk utbyte (används för separation av karboxylsyraföreningar).