Abstrakt
hårfollikeln är ett hudintegument vid gränsen mellan en organism och dess omedelbara miljö. Den mänskliga hårfollikelns biologiska roll har förlorat en del av sin förfädernas betydelse. En fördjupad undersökning av denna miniorgan avslöjar dock dold komplexitet med stor forskningspotential. Ett viktigt övervägande när det gäller mänsklig forskning är medvetenheten om potentiell skada och därmed det absoluta behovet att inte skada—en regel som är lämplig kvalificerad av den latinska termen ”primum non nocere” (först gör ingen skada). Den plockade håraxeln erbjuder sådana fördelar. Användningen av stamceller som finns i hårsäckceller får fart inom regenerativ medicin. Vidare inkluderar nuvarande diagnostiska och kliniska tillämpningar av plockade hårsäckar deras användning som autologa och/eller tredimensionella epidermala ekvivalenter, tillsammans med deras användning som surrogatvävnad i farmakokinetiska och farmakodynamiska studier. Följaktligen kan användningen av icke-invasiva diagnostiska procedurer på hårsäcksaxlar, som poserar som en surrogatmolekylär modell för inre organ i den enskilda patienten för ett spektrum av mänskliga sjukdomstillstånd, eventuellt bli verklighet inom en snar framtid.
1. Inledning
hårsäcken är ett hudintegument vid gränsen mellan en organism och dess omedelbara miljö. Det är den evolutionära släktingen av skalan, fjädern och nageln, integument som har tjänat en viktig roll i organismernas överlevnad . Den mänskliga hårfollikelns biologiska roll har förlorat en del av sin förfäders betydelse; en fördjupad undersökning av denna miniorgan avslöjar dock dold komplexitet med stor forskningspotential. Författarna Paus och Foitzik beskriver hårsäcken som en unik däggdjurskaraktäristik med ett stamcellsrikt, prototypiskt neuroektodermalt-mesodermalt interaktionssystem. Det beskrivs som ett däggdjursorgan som genomgår cykliska omvandlingar från stadier av snabb tillväxt (anagen) till apoptos-driven regression (catagen) och tillbaka till anagen, via en interspersed period av relativ quiescence (telogen) som kvarstår under djurets livstid .
denna miniorgan har studerats både in vitro och in vivo, hos djur och hos människor. Varje tillvägagångssätt har fördelar och nackdelar, men det råder ingen tvekan om att mänsklig forskning, som möjliggör minimal störning, ger mycket relevanta resultat. Ett viktigt övervägande när det gäller mänsklig forskning är medvetenheten om potentiell skada, och därmed det absoluta behovet att inte skada en regel som är lämplig kvalificerad av den latinska termen ”primum non nocere” (först gör ingen skada). Den plockade håraxeln erbjuder sådana fördelar.
håraxlar är vanliga, små och lätt att få utan större obehag för individen som deltar i forskningen. Håraxlar representerar mänsklig vävnad som kan samplas över olika tidpunkter. Denna miniorgan har både neuroektodermalt och mesodermalt ursprung samt fungerar som en källa till stamceller. Detta dokument kommer huvudsakligen att fokusera på användningen av den plockade håraxeln för mänsklig medicinsk forskning och dess framväxande potential.
2. Plucked hair Shaft Anatomy and Integrity
den intakta hårsäcken (se Figur 1) kan enkelt beskrivas ur histologisk synvinkel som ett minutkluster av enhetliga epitelceller, intill en liknande storlek aggregering av enhetliga mesenkymala celler. Det är ett organ som består av fem eller sex koncentriska cylindrar, som var och en består av celler av en distinkt typ, som syntetiserar sin egen distinkta uppsättning proteiner . En detaljerad biologi av den intakta hårsäcken finns i artikeln publicerad av Paus och Cotsarelis .
grafisk representation av en typisk hårsäck, som visar de regioner som möjliggör follikelgenerering och differentiering, tillsammans med dermal papilla och follikelmatris.
att få en intakt hårsäck är endast möjlig med hjälp av en hudbiopsi. Detta invasiva förfarande begränsar tillgängligheten, främst till vävnad som erhållits under andra kirurgiska ingrepp, såsom hudöverskottet som erhållits under ansiktslyftkirurgi och prover som erhållits under hårtransplantationsförfaranden. Plockning av håraxlar är en alternativ, mindre invasiv teknik. Det är emellertid frågan om hur många celler som kommer upp med upprotningen av follikeln och vilka typer av celler som kommer ut med en sådan metod.
Även om den plockade håraxeln är klart underlägsen i cellulär kvantitet och komplexitet till en intakt hårfollikel som erhållits genom en biopsi, bär den tillräcklig cellmassa för att tillåta detaljerade vetenskapliga undersökningar. Moll använde den plockade hårsäcken för att identifiera regioner med störst tillväxtpotential i odling samt analysera genuttryck och proteinanalyser i de olika segmenten av de plockade folliklarna .
vid jämförelse av hematoxylin-och eosin-färgade hårsäckar härledda från hudbiopsier och från plockade hår med ljusmikroskopi visade Gho och kollegor att de flesta epitelstrukturerna från hårsäcken förblir fästa vid det plockade håret . Upprätthållandet av integriteten hos det yttre rotarket efter hårplockning är ett möjligt resultat och har dokumenterats av Limat och kollegor . Plockning av hårsäckar tillåter undersökning av pigmentceller, ett tillvägagångssätt som genomfördes på 1950-talet av Barnicot och kollegor som var bland de första som studerade den plockade håraxeln under elektronmikroskopi . Mänskliga anagen hårbotten hårlökar undersöktes med ljusmikroskopi för att undersöka de anatomiska effekterna av mekanisk plockning . Intressant visade studien att anagen hårlökar rivs av i reproducerbara mönster . Bortsett från den ”typiska” pausen koniskt kring den dermala papillen beskriver författarna också fyra ytterligare brytformer : (1)bristning av håret runt den övre tredjedelen av papillen vilket resulterar i dysplastiska anagenhår i trichogrammet, (2)bristning av håret långt över den dermala papillen vilket resulterar i ”trasiga” anagenhår, (3)Totalt avlägsnande av det proximala follikelepitelet med avlägsnande av den dermala papillen vilket resulterar i så kallade papillahår i trichogrammet ;(4)den andra effekten av plockning på hårsäcken är förändringen av den mesenkymala manteln, vilket ger upphov till blödningar och ödem som ökar volymen av både den dermala papillen och den underliggande ”papilla kudde” av Pinkus.
de avbrottstyper som beskrivs av Bassukas och Horstein beror möjligen antingen på olämpliga plockningstekniker eller på grund av de olika delfaserna i anagenstadiet .
ett system för staging plockade håraxlar har beskrivits av Camidge och kollegor i deras papper om användningen av plockat människohår som en vävnad som kan användas för att bedöma de farmakodynamiska slutpunkterna under läkemedelsutvecklingsstudier . Hår undersöktes med ljusmikroskopi för att utvärdera kärnfärgning i termer av dess närvaro/frånvaro, platsen för färgning och hårets Stadium . Varje hår med en synlig glödlampa och rotmantel fotograferades och arrangerades (0, 1, 2 eller 3), enligt ett skräddarsytt system baserat på avståndet från mantelens nedre marginal från lampans botten .
steg 0 definierades som mantel som omfattar glödlampan, steg 1 < 150 occurm, steg 2 = 150-699 occurm och steg 3 > 700 occurm. Hår som noterades vara utan synliga lökar och mantlar som inte hade uteslutits tidigare vid den första ögonundersökningen kasserades .
studierna som beskrivs ovan har lagt grunden för en reproducerbar vetenskaplig klassificering av plockade hårsäckar, med tanke på den möjliga olika effekten av plockning på histologin hos den vävnad som undersöks.
3. Stamceller och plockade håraxlar
epidermis har två stamcellsförvar, en Finns i basskiktet av interfollikulär epidermis och den andra i hårsäcken. Användningen av stamceller som finns i hårsäckceller får fart inom regenerativ medicin. Detta har skapat behovet av att identifiera den exakta platsen i hårsäcken och att utforma enkla metoder för att komma åt sådana celler som från plockade hårsäckar som är lättillgängliga.
Moll utförde studier om lokalisering av kolonibildande celler i humana plockade håraxlar . Utredarna använde anagen hårbotten plockade hår för att bekräfta närvaron av ett intakt yttre rotark såväl som den proliferativa potentialen hos de olika keratinocyterna . För att uppnå lokalisering avgränsades fem segment av den yttre rotmanteln (ORS), B1, B2, B3-1, B3-2 och B4 med hjälp av mikrodissektion. Det visade sig att kolonibildande förmåga mestadels märktes i mellandelen (B2) och den nedre halvan av den centrala delen (B3-1) . Den längsta in vitro-livslängden hittades i fragmentet B3-2 och det kortaste i fragmentet B1 (glödlampa) . Eftersom de högkolonibildande förmåga celler lokaliserade i de nedre centrala delarna av ORS keratinocyterna vanligtvis avlägsnas genom plockning, kommenterar författarna att de därför inte kan representera stamceller utan snarare celler som är viktiga för hårväxt under en enda cykel . Celler med långa livslängder lokaliserades i centrala delar av den yttre rotmanteln nära utbuktningsområdet, medan celler med långa livslängder också inkluderade i plockade hårsäckar kan vara en omedelbar avkomma av stamceller som skulle segregeras i utbuktningsområdet .
Gho och kollegor undersökte och bekräftade närvaron av stamceller i plockade anagen hårsäckar från hårbotten occipital område . Detta uppnåddes genom att testa för cytokeratin 19, en markör som Michel et al hävdar. att vara positiv för stamceller; de lokaliserade indirekt dessa celler . Det hävdades också att, eftersom stamceller krävde skydd mot apoptotisk hårcykel, skulle undersökning av apoptos-undertryckande Bcl-2-protein tillsammans med frånvaron av apoptosfrämjande Bax vara en annan tillförlitlig metod genom vilken utredarna kunde leta efter närvaron av stamceller .
en annan tillförlitlig metod för att identifiera keratinocytstamceller använder sig av det faktum att dessa celler normalt är långsamma, varför kan identifieras experimentellt som ”etiketthållande celler” (LRCs) . I detta tillvägagångssätt märker man alla celler i epitelet genom en upprepad eller kontinuerlig tillförsel av tritierad tymidin, följt av en lång jaktperiod under vilken etiketten går förlorad från alla cykel -, transitförstärkande (TA) celler, vilket gör att endast celler som cyklar långsamt (stamcellerna) behåller etiketten . Långsamma cykelceller i hårsäcken hittades av Taylor och kollegor för att vara uteslutande begränsade till ett tidigare ignorerat område som kallas utbuktningen, med den delen av den yttre rotmanteln som markerar den lägsta punkten på den övre, permanenta delen av follikeln, liksom fästplatsen för arrector pili-muskeln.
Yamauchi och Kurosaka undersökte närvaron av stamceller i utbuktningsområdet av plockade hårsäckar från hårbotten . Utredarna fokuserade på närvaron av glykogensyntaskinas-3 (GSK-3), ett protein som, efter att ha hämmats, ökar halterna av Bisexuell-katenin som är direkt involverade i hårsäckmorfogenes och stamcellsdifferentiering . Närvaron av GSK – 3 i denna region bekräftades genom att leta efter dess genetiska uttryck genom RT-qPCR och genom western blotting med en GSK-3 beta-specifik antikropp, Y174 . Sasahara et al. detekterade stamceller i utbuktningsområdet genom närvaron av CD34-uttryck, som är en stamcellsbiomarkör tillsammans med andra stamcellsbiomarkörgener som CD200, Sox2 och NANOG . Morfologi och uttryck av keratinfamiljgener i bulge-härledda folliklar (BDKs) före och efter differentieringsinduktion med kalciumklorid liknade de hos epidermala keratinocyter erhållna från hudbiopsier (NHEKs) . De visade också att BDK var mer eldfasta mot differentiering än epidermala keratinocyter erhållna från hudbiopsier .
3.1. Mänskliga follikel-härledda keratinocyter
Yoshikawa et al. undersökte uppreglering av gener som är involverade i keratinocytdifferentiering, specifikt den nya markörgenen ID2 . De uppnådde detta genom att använda kontaktsensibilisatorer i odlade keratinocyter härledda från utbuktningen av plockade Håriga folliklar, även kända som bulge-derived keratinocytes (BDKs) . Deras teknik var en effektiv och enkel metod för att etablera stammar av humana BDKs, utan användning av invasiva hudbiopsier . BDKs visade primära svar på sensibilisatorer åtföljda av uppreglering av generna som orkestrerar keratinocytdifferentiering, inklusive ID2-genen och den NRF2-medierade signalvägen . BDK: er etablerades individuellt utan invasiva biopsier och blev eventuellt ett kraftfullt verktyg för att utvärdera givare-till-givare-variationer till sensibiliserarna .
3.2. Omprogrammering av stamceller från plockad håraxel
omprogrammering av somatiska celler till inducerade pluripotenta stamceller (iPS) kan uppnås genom tvingat uttryck av specifika transkriptionsfaktorer, särskilt kombinationen av Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc (OSKM) . Dessa programmerade celler liknar embryonala stamceller (ES) och kännetecknas av obegränsad självförnyelsepotential och förmågan att differentiera till vilken celltyp som helst . Tekniken för att generera iPS-celler har revolutionerat fältet som undersöker de molekylära mekanismerna för cellulär pluripotens och underlättat genereringen av patientspecifika celler för cellersättningsterapi . Etiska och värd-avvisande frågor som vanligen förknippas med ES cellteknik har minskat, generera stort intresse och löfte för framtida kliniska tillämpningar . Omprogrammering är långsam och ineffektiv, och den fulla omfattningen av huruvida IPS-celler kan ersätta ES-celler i alla aspekter diskuteras fortfarande, och partiell omprogrammering eller ”överprogrammering” utgör utmaningar .
keratinocyt-härledda iPS-celler (KiPS) kan fastställas från små mängder biologiskt prov inklusive plockade hår. Ett stort antal keratinocyter har framgångsrikt odlats från plockat hår . Ett enda hår plockat från en 30-årig kvinna har använts av Aasen et al. för att generera keratinocytinducerade pluripotenta stamceller . En experimentell modell för att undersöka baserna för cellulär omprogrammering och potentiella fördelar med att använda keratinocyter för att generera patientspecifika iPS-celler beskrivs . Aasen och Belmonte beskriver en metod som använder plockade hår Ors keratinocyter och anger att direkt plockning av hår kommer att isolera huvudsakligen transiteringsförstärkande celler med kortvarig odlingspotential .
stamceller härledda från plockade hårsäckar har framgångsrikt omprogrammerats till två mycket viktiga och relativt otillgängliga vävnader, neurala celler och hjärtceller . Omprogrammering uppnåddes genom användning av en enda polycistronisk exciserbar lentiviral vektor . Novak et al. visade att alla kolonier var sanna IPSC, hade typiska egenskaper hos mänskliga embryonala stamceller och differentierades i alla de tre bakterielagren både in vitro och in vivo . Följaktligen härleddes funktionella hjärtmyocyter framgångsrikt och karakteriserades från humana hårfollikelkeratinocyter HFKT-iPSCs och uppvisade välkoordinerade intracellulära Ca2+ transienter och sammandragningar .
i en annan studie av Petit och kollegor visade sig keratinocyter som isolerades från hårsäckar vara en idealisk källa till patienters celler för omprogrammering . De använde bara ett litet antal plockade mänskliga hårsäckar från två friska givare för att omprogrammera keratinocyter till pluripotenta stamceller . Gruppen lyckades också ytterligare differentiera dessa programmerade stamceller till neurala förfäder, inklusive framhjärnneuroner och funktionella dopaminerga neuroner .
granskningsdokumentet av Muller et al. nämner modellering av mänskliga kanalopatier plockade hårsäckar som en lättillgänglig källa till iPSCs. Genererade IPSC anses vara ett användbart verktyg för att belysa patofysiologiska mekanismer i olika sjukdomstillstånd, bland vilka nämns diabetes, blodsjukdomar, definierade neurologiska störningar och genetisk leversjukdom . Linta et al. används human keratinocyte härledda inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) för att titta på mRNA-uttrycksnivåer av jonkanalgener mellan sådana celler och deras somatiska cellkälla, keratinocyter från plockat människohår .
4. Genuttrycksprofilering
Genuttrycksprofilering (GEP) är en viktig forskningsväg för att förstå hur celler och vävnader fungerar under normala förhållanden, karakteriserar svaren på toxikologiska eller farmaceutiska exponeringar och belyser molekylära mekanismer associerade med åldrande, sjukdomsutveckling och progression. Flera författare har använt RT-qPCR för att analysera uttrycket av ett begränsat antal gener i vuxna plockade mänskliga hårsäckar . Kim et al. markera det faktum att RNA av tillräcklig kvantitet och kvalitet som ska användas i mikroarrayhybridiseringar kan erhållas från en enda plockad mänsklig hårfollikel . Det genomsnittliga kvantifierbara utbytet av RNA / follikel var 112,5 ng . Ribosomala förhållanden var lägre än normalt förväntat, men undersökningen visade att RNA var intakt . De fullständiga uppgifterna om gener uttryckta i hårsäckar hos var och en av de 10 försökspersonerna som undersöktes i deras studie deponerades med genuttrycket omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) .
Ohyama et al. visade att mänsklig utbuktningscellbiologi kunde underlättas genom analys av globala genuttrycksprofiler och identifiering av unika cellytmarkörer . Studier av utbuktningsceller har hindrats av bristen på distinkt utbuktningsmorfologi i mänskliga hårsäckar . Med hjälp av navigerad laserfångstmikrodissektion bestämde författarna fördelningen av etiketthållande celler för att definiera den mänskliga anagenbulten . Genavskrifter som kodar för hämmare av Wnt och aktivin/benmorfogen proteinsignalering var överrepresenterade i utbuktningen, medan gener som ansvarar för cellproliferation var underrepresenterade, i överensstämmelse med förekomsten av vilande icke-cyklande KSC i anagenfolliklar .
jämförande genuttrycksprofilering har använts för att skilja atopiskt eksem från icke-atopiskt eksem . Mänskliga hårfollikel-härledda keratinocyter (FDKs) odlades från plockade hår som tagits från de två grupperna . Mikroarrayanalys och kvantitativ RT-PCR användes för att generera genuttryckssignaturer som kan skilja atopisk dermatit från icke-atopiska kontroller utan hudbiopsier . Patient härledda FDKs, individuellt etablerade utan invasiva biopsier, kan vara en idealisk cellkälla för att studera hudsjukdomar in vitro .
5. Diagnostiska och kliniska tillämpningar av plockat hår
plockade håraxlar blir ett användbart diagnostiskt verktyg vid dermatologiska förhållanden. Direkt immunofluorescens (DIF) av perilesional hud är guldstandarden vid diagnosen pemphigus . Rao et al. har använt ORS av plockade anagen håraxlar för att upptäcka pemphigus-specifikt immunofluorescensmönster och drog slutsatsen att DIF av plockat hår är ett enkelt, icke-invasivt test som i framtiden kan lindra behovet av hudbiopsier hos patienter med pemphigus .
5.1. Autolog Epidermal ekvivalent
keratinocyter av den yttre rotmanteln av plockade anagen hårsäckar användes av Tausche et al. att generera helt differentierade autologa epidermala ekvivalenter . De rapporterar resultat från en multicenter, randomiserad fas II-studie för EpiDex, ett varumärke av en vävnadsteknisk, helt differentierad autolog epidermal ekvivalent som var lika effektiv som delad tjocklek hud autografting i främjandet av läkning och fullständig stängning av motstridiga vaskulära bensår . Limat et al. används autologa in vitro rekonstruerade epidermala ekvivalenter och visade att efter 2 månader kunde en tredjedel av återkommande bensår läka . Användningen av autologa keratinocyter isolerade från plockade mänskliga hårbotten hårsäckar visade sig erbjuda ett antal fördelar, inklusive den enkla, icke-invasiva isoleringen av ORS keratinocyter från plockade anagen hårsäckar och deras förmåga att upprätthålla en hög proliferativ kapacitet i kultur, även när de härrör från mycket gamla givare .
5.2. Tredimensionella Hudekvivalenter
tredimensionella hudekvivalenter (SE) har använts i farmakologisk och toxikologisk forskning för att ersätta djurförsök och cellmonokulturer . Dessutom är de framgångsrika verktyg för ympning av kroniska sår eller bränd hud och i transplantationsmedicin. Hoeller et al. utvecklat en förbättrad och snabb metod för att konstruera autologa SEs från mänskliga plockade hårsäckar och fibroblaster . Genom att använda anagenfas plockade håraxlar som valdes genom ljusmikroskopi och implanterade dem i dermala ekvivalenter förkortades processen för att generera autologt SE från 30 till 20 dagar .
5.3. Surrogatvävnad i farmakokinetiska/farmakodynamiska studier
plockade hårsäckar har gått med i listan över surrogatvävnader för cancerforskning tillsammans med perifera blodmononukleära celler (Pbmc), trombocytrik plasma, hudbiopsier och orala buccal swappar. Vävnadsbaserade metoder för att studera farmakodynamiska slutpunkter i kliniska prövningar i tidig fas har ökat sedan utvecklingen av riktade läkemedelsbehandlingar där den optimala biologiska dosen skulle föredras framför den maximalt tolererade dosen. Definitionen av optimal dos kan fastställas baserat på farmakokinetiska slutpunkter eller företrädesvis genom att visa önskad effekt på målmolekylen.
författarna Camidge et al. har beskrivit användningen av plockade hårsäckar och genomförbarheten vid detektering och kvantifiering av cellcykel och DNA-reparationsrelaterade faktorer, såsom Ki67, pRb, p27 och fosforylerad p27, pRb och histon . Effekten av antitumörhämmare av fosfatidylinositol-3-Kinas (PI-3-K)/Akt (proteinkinas B) signalering hos cancerpatienter har uppmätts med Williams et al. . Plockade hårbotten hårsäckar användes som surrogat normala vävnader för att mäta effekterna av hämmare av PtdIns-3-Kinas och Akt på ptdins-3-Kinas signalering . Studien visade att fosfoser473-Akt-färgning i keratinocyterna i hårets yttre mantel hämmades av en PtdIns-3-kinashämmare i odlat människohår . Resultaten av studien tyder på att enskilda mänskliga hår kan ge ett minimalt invasivt sätt att mäta effekterna av ptdins-3-Kinas signaleringshämmare hos patienter som återspeglar hämning av tumörfosfo-Akt .
plockade håraxlar extraherade från ögonbrynen såväl som mononukleära celler i perifert blod har använts av Fong et al. som surrogatvävnad för att testa hypotesen att patienter med tumörer associerade med BRCA1-eller BRCA2-mutationer skulle visa ett objektivt antitumörsvar mot olaparib, en ny och potent, oralt aktiv Poly(adenosindifosfat-ribos) polymeras (PARP) hämmare . I en klinisk fas 1-studie undersöktes säkerheten, biverkningsprofilen, den dosbegränsande toxiciteten, den maximalt tolererade dosen, den dos vid vilken PARP hämmas maximalt och dess farmakokinetiska och farmakodynamiska profiler . Plockade ögonbryn hårsäckar tillsammans med perifert blod mononukleära celler användes för att bekräfta PARP hämning i dessa surrogat prover . Liknande, Ang et al. granskade motiveringen, fördelarna och nackdelarna och de praktiska övervägandena av vävnadsbaserade metoder för att utföra farmakodynamiska studier i kliniska prövningar i tidig fas onkologi med hjälp av fallhistorier av molekylära inriktningsmedel såsom PI3K, m-TOR, HSP90, HDAC och PARP-hämmare .
6. Perspektiv
den plockade håraxeln har använts i medicinsk forskning under de senaste 60 åren. Detta” mini ” – organ blir en viktig testplats inom biomedicinsk forskning. En mest spännande roll för plockade håraxlar utvecklas inom stamcellsprogrammering och utveckling av autologa epidermala ekvivalenter. Användningen av plockad håraxel som surrogatvävnad i fas 1-studier för kemoterapeutisk läkemedelsutveckling samt dess användning som en surrogatvävnadsmodell i systembiologiska metoder för medicinsk forskning kommer att bli viktigare i den närmaste framtiden.
bekräftelse
författarna vill tacka Mr. Anton Abela (Institutionen för klinisk farmakologi och terapi, fakulteten för medicin och kirurgi, University of Malta) för att utforma figuren som presenteras i detta dokument.