tillkomsten av aerob biologi förebådades omkring två miljarder år sedan, när primitiva cyanobakterier utvecklat förmågan att photooxidize vatten. Syre släpptes som en avfallsprodukt och atmosfäriska O2-nivåer steg snabbt. Denna snabba förändring till en syrehaltig atmosfär införde ett förödande förorenande ämne, men så småningom utvecklades organismer som utnyttjade den starka drivkraften för O2-reduktion. Enzymaktiva platser som kunde binda och aktivera syre utvecklades och nya klasser av biokemi som använder O2 som en termodynamisk diskbänk för att driva annars ogynnsamma reaktioner blev möjliga. Effektiviteten av livsmedelsmetabolism förändrades dramatiskt. Mängden ATP som kunde produceras genom att metabolisera glukos aerobt ökade till exempel nästan 20 gånger. Eukaryoter dök upp strax efter syreatmosfären och följdes så småningom av det olika utbudet av multicellulär organism som finns idag. I vår aeroba biokemi används O2 i en mängd syntetiska reaktioner som är grundläggande för nästan alla aspekter av celltillväxt, utveckling och reproduktion.
trots sin biokemiska mångsidighet används emellertid >95% av syret som vi konsumerar vid andning. Högenergielektroner härledda från mat passerar mitokondriell elektrontransportkedja i en serie exergoniska redoxreaktioner. Dessa energiskt nedförsbacke elektronöverföringar används för att utveckla den kemisosmotiska protongradienten som i slutändan producerar ATP. Syre är den slutliga elektronacceptorn i denna respiratoriska kaskad, och dess reduktion till vatten används som ett fordon för att rensa mitokondriell kedja av lågenergi, förbrukade elektroner. Enzymet som katalyserar denna process, cytokromoxidas, spänner över mitokondriemembranet. Det binder, aktiverar och minskar upp till 250 molekyler O2 per sekund och kopplar den energi som frigörs i denna process till translokation av protoner som bidrar till den kemiosmotiska gradienten. Mekanismen genom vilken cytokromoxidas katalyserar denna anmärkningsvärda kemi har studerats intensivt. Resultaten som rapporteras i denna utgåva av Fabian, Wong, Gennis och Palmer ger ny inblick i denna process och stöder den växande uppfattningen att förenande begrepp finns för det sätt på vilket syreanvändande enzymer aktiverar O2 för O-Kubi o-bindning klyvning och reduktion (1).
reduktionen av O2 i cytokromoxidas sker under allvarliga begränsningar. Processen äger rum med liten överpotential, frisättningen av delvis reducerade, giftiga syreintermediärer från den aktiva platsen minimeras och den fria energin som finns tillgänglig i O2-reduktion kopplas med hög effektivitet till protontranslokation (2, 3). Enzymet verkar under dessa begränsningar genom att använda en heme Fe, kallad heme a3, och en kopparjon, benämnd CuB, i ett binukleärt centrum där O2 binder och reduceras (se Fig. Fig.1).1). Elektroningång till denna plats sker från cytokrom c genom ett andra hemjärn, heme a och ett andra kopparcentrum, CuA. Nyligen gav Yoshikawas Grupp (4) och Michels Grupp (5) oberoende och samtidigt kristallstrukturer av enzymet som har gett djup inblick i många aspekter av den katalytiska cykeln, särskilt hur protoner och syre sannolikt kommer att röra sig genom proteinet. Mekanismen för O2-reduktion med oxidas har bedrivits av ett antal grupper med olika spektroskopiska tekniker (för recensioner, se refs. 6 och 7). Från detta arbete kan en förenklad reaktionssekvens som involverar övergående men detekterbara mellanprodukter vid binukleärcentret skrivas enligt följande (Se även Fig. Fig.2): 2):
särskilt p-och f-arterna har väckt uppmärksamhet, eftersom de har varit inblandade i pumpmekanismen som driver protontranslokation (8). Nyligen arbete från Michel (9) och från Wikstru och medarbetare (10) har belyst både framsteg och osäkerheter i vår förståelse av mekanismen som par exergonisk elektron överför till syre med endergonisk protonrörelse över membranet.
binukleärt centrum i cytokromoxidas. Heme a3 och CuB visas tillsammans med den proximala liganden för heme-järnet, H376 och CuB-liganden, H240, som är tvärbunden till Y244 (24, 25). O2-bindning och reduktion sker i regionen mellan A3-järnet och CuB.
ett förenklat schema för reaktionen mellan cytokromoxidas och O2. Den binukleära platsen, som innehåller heme a3, CuB och den tvärbundna, H240-Y244 (H – Y) strukturen, visas. Reduktion och protonation av den oxiderade formen av mitten ger den reducerade platsen. Detta binder O2 för att initialt bilda oxy-arten, som reagerar vidare för att producera p-och F-intermediärer, innan de regenererar den oxiderade formen av enzymet. Reduktionen av P och F begränsas av protonöverföringsreaktioner, såsom anges. Stegen mellan P och den reducerade formen av platsen har varit inblandade i protonpumpningsprocesser, vilka indikeras med röda pilar. Stökiometrin för dessa steg är en fråga om aktuell undersökning, även om upp till fyra protoner kan pumpas under hela cykeln.
en fortsatt fråga i unraveling syrekemin vid binukleära centrum i cytokromoxidas och dess koppling till protonpumpen är att fastställa de molekylära strukturerna hos mellanprodukterna i schemat ovan. Det finns enighet om att f-mellanprodukten involverar en ferryl-oxo-mellanprodukt vid heme a3, A34 + (3, 6, 11, 12), Men p: s struktur har varit en fråga om betydande kontroverser. De första tilldelningarna av denna art postulerade att den innehöll en bindning intakt, A33+—O2 msk arter, därav dess beteckning som P för ”peroxi” (t.ex. refs. 3, 8 och 13). Weng och Baker tolkade emellertid sina optiska data för att indikera att O-O-bindningsklyvning redan hade inträffat vid P och att denna art också hade en A34+ – o-struktur i binukleärcentret (14). Denna slutsats stöddes därefter av flera spektroskopiska undersökningar (15-17). Kitagawa, Proshlyakov och deras medarbetare lyckades använda Raman-spektroskopi för att detektera A34+o-sträckningsrörelsen (18, 19) i en form av P genererad genom tillsats av peroxid till det oxiderade enzymet. Efterföljande arbete visade att samma vibration kunde observeras när syre tillsätts till en tvåelektronreducerad form av enzymet, vilket bekräftar att syrekemi och peroxidkemi i oxidas fortsätter genom vanliga mellanprodukter (20). Dessutom visade tidsförloppet för utseendet av P i detta arbete att denna art är kinetiskt Kompetent (se även refs. 21 och 22). Således, från det spektroskopiska arbetet, och från det senaste beräkningsarbetet också (23), är den framväxande uppfattningen att P verkligen är en O-O-bind-klyvda arter.
det arbete som rapporterats av Fabian et al. (1) ger nya, oberoende och övertygande bevis för att O-O-bindningen O-O-bindningen klyvs i cytokromoxidas på P-nivån. I sina experiment motiverade de att varken syreatom i en bindningsintakt peroxistruktur sannolikt kommer att bytas ut med lösningsmedelsvatten. Om P förekommer som A34 + o-arten, förväntar man sig dock att den andra syreatomen troligen är i nivå med hydroxid eller vatten och att detta syre mycket väl kan bytas ut med vatten i den vattenhaltiga bufferten. Med användning av 18O2 som substrat i en vattenhaltig buffert som innehöll H216O fångade de p-mellanprodukten och analyserades för utseendet av H218O. Deras masspektrometriska resultat visar tydligt att en enda syreatom från 18o2-substratet kan bytas ut med lösningsmedelsvatten, i utmärkt överensstämmelse med deras analys ovan och tilldelningen av P som en bindning-klyvad, ferryl-oxo arter.
insikten om att P har en A34 + o-struktur har ett antal viktiga konsekvenser. Omvandlingen av bunden O2 i oxy-arten till hydroxid (eller vatten) och en ferryl-oxo i P kräver totalt fyra elektroner. Endast tre är emellertid lätt tillgängliga i binuclear center—två från heme a3 när det går från +2 till +4 valenstillstånd och en från CuB eftersom den oxideras från cuprous till cupric. Källan till den fjärde elektronen är oklar. Oxidation av hemmakrocykeln, som förekommer i föreningar I i vissa peroxidaser, kan elimineras på basis av Raman och optiska data (6, 7) och Cu3+ har inte detekterats i biologisk miljö. Den mest sannolika kandidaten är då en redox-aktiv proteinsidokedja, som förekommer i cytokrom C-peroxidas, där tryptofan är redoxaktiv eller i prostaglandinsyntas, som innehåller en oxiderbar tyrosinrest (24). Yoshikawa och medarbetare (25) gav slående kristallografiska bevis som starkt stöder förekomsten av en redox-aktiv sidokedja. De visade att Y244 i binukleärcentret är tvärbunden till en av CuB-liganderna, H240, och att fenolhuvudgruppen är orienterad så att −OH-gruppen pekar direkt in i O2-bindande hålighet (Fig. (Fig.1).1). Michel har rapporterat liknande kristallografiska data (26), och Buse och medarbetare har nyligen rapporterat biokemiska data som stöder förekomsten av H240-Y244 tvärbindning (27). Nya EPR-data har också rapporterats som indikerar närvaron av tyrosylradikaler när peroxid tillsätts till det vilande enzymet, även om de specifika sidokedjorna inte har identifierats(28, 29). Sammantaget tyder dessa resultat starkt på att det tvärbundna tyrosinet är källan till den fjärde elektronen vid aktivering och reduktion av O2 med cytokromoxidas. Denna gissning leder till den förenklade reaktionscykeln i Fig. Fig.2,2, i vilken den tvärbundna H-y-strukturen visas uttryckligen och föreslås oxideras till den neutrala tyrosylradikalen i P-mellanprodukten.
schemat i Fig. Fig.22 belyser analogierna mellan cytokromoxidas och peroxidaser och katalaser i termer av syre–syrebindning klyvningskemi och i termer av de produkter som härrör från reaktionen. I oxidas extraherar enzymet tre elektroner från metaller i det aktiva stället och en fjärde elektron från en organisk del för att minska O2 i ett steg till o—o-och OH -. Båda dessa produkter ligger på vattennivån, även om ytterligare protonation och frisättning endast sker i senare steg av reaktionen. I peroxidaser och katalaser extraherar enzymet en elektron från en metall på det aktiva stället och en andra elektron från en organisk del för att reducera H2O2 i ett steg till o—o-och OH -. I peroxidaser och katalaser är den omedelbara produkten av denna kemi förening I, som innehåller en ferryloxoart och en organisk radikal. Dessa strukturer är exakt analoga med A34 + o/radikal o-struktur som förekommer i P i cytokromoxidas. Den organiska radikalen i förening i reduceras i ett efterföljande steg i peroxidas-och katalasenzymerna för att producera förening II, som upprätthåller ferryl-oxo-strukturen. I oxidas uppstår samma kemi för att producera f-mellanprodukten. Likheten i kemi hos de syremetaboliserande hemeproteinerna har bara uppstått med förverkligandet av A34 + o-strukturen för O för p och antyder att andra syremetaboliserande enzymer kan följa samma typ av kemi för att aktivera och minska syre och peroxider.
en intressant strategi framgår av Fig. Fig.22 när det gäller hur oxidas kopplar syrekemi till protonpumpen. Pumpstegen inträffar först efter att P har bildats (8-10), vilket innebär att enzymet först aktiverar och reducerar O2 till helt reducerade men ofullständigt protonerade produktvattenmolekyler; enzymet fullbordar fyra-elektronöverföringen av elektroner till syre och lagrar den fria energin som resulterar som mycket oxiderande A34+2BG O och radikala arter innan pumpen kopplas in. Nya beräkningar på bind-klyvningskemi stöder denna uppfattning, eftersom resultaten indikerar att reduktion av O2 till oxo och hydroxo med bildning av en radikal och en ferryl-oxo ligger nära termoneutral (23). Detta representerar en anmärkningsvärt effektiv strategi för att undvika giftiga, delvis reducerade syrearter, eftersom ingen förekommer i reaktionscykeln. Genom att överföra den fria energin som kommer att användas för att driva pumpen från substat syreprodukter till proteinet verkar det som om oxidas har maximerat kontrollen och effektiviteten med vilken den kan driva protontranslokationsapparaten.