under translokationssteget i förlängningsfasen av proteinsyntesen, förflyttas mRNA med ett kodon, kopplat till rörelse av tRNA från ribosomal A (aminoacyl) till P (peptidyl) och P till e (exit) platser, i en process katalyserad av förlängningsfaktor EF-G (1). Först flyttar tRNA på 50s-subenheten till P/E-och A / P-hybridtillstånd, följt av rörelse av tRNA-antikodon-stamslingorna (ASL) från 30s-subenheten A-och P-platser till P-respektive e-platserna kopplade till rörelse av deras associerade mRNA-kodoner (2). Det första steget åtföljs av intersubenhet rotation (3-7), medan det andra steget kräver EF-G·GTP, och innebär rotation av 30s subenhet huvuddomän (8-11). Även om mycket nyligen har lärt sig om den strukturella grunden för p-tRNA-rörelsen till e-platsen (9, 10, 12, 13), translokation mellanprodukter som innehåller A-tRNA är svårare att fälla. Således har mycket av vårt tänkande om den strukturella grunden för a-tRNA och mRNA-rörelse baserats på kristallstrukturer av EF-G bundna till lediga (14) eller P-tRNA-innehållande ribosomkomplex fångade i klassiska (15) eller hybridtillstånd (10, 12, 13) och två cryo-EM-strukturer av 70s ribosom-EF-g-komplex innehållande två tRNA bundna i P/E och A/P* hybridtillstånd (16), eller i ap/P och pe/e chimära hybridtillstånd (11).
här rapporterar vi kristallstrukturen hos en 70s ribosomtranslokation mellanprodukt innehållande EF-G, mRNA och två tRNA – en deacylerad tRNA bunden i pe/E-tillståndet och en peptidyl-tRNA fångad i ett ap/ap-chimärt hybridtillstånd. Komplexet bildades med T. thermophilus 70s ribosomer, en 39-nukleotid mRNA, elongator tRNAMet i P-platsen och N-acetyl-Val-tRNAVal i A-platsen. För att fånga translokationsmedlet tillsatte vi neomycin för att blockera slutförandet av translokation och fusidinsyra för att förhindra frisättning av EF-G (kompletterande metoder; Fig. S1). Strukturen löstes med användning av diffraktionsdata till 3,8 Ghz erhållen från en enda kristall (tabell S1). Exempel på elektrontäthet visas i kompletterande material (Fig. S2-S13). I förhållande till den klassiska tillståndsribosomen (17) genomgår 30s-underenhetshuvudet en stor rotation på 21 kg moturs och 30s-kroppen en rotation på 2,7 kg i förhållande till 50s-underenheten (Fig. 1, Fig 2A, B). P-tRNA-antikodon-stamslingan (ASL) rör sig med 30s-huvudet i en position mellan P-platsen för 30s-huvudet och e-platsen för 30s-kroppen (pe-chimär tillstånd; Fig 1D, E), medan dess acceptorände rör sig helt in i 50s e-platsen (Fig 1c) och bildar ett pe/E-chimärt hybridtillstånd (9-11). A-tRNA ASL rör sig till inom ~4 kcal av P-platselementen i 30s-kroppen (Fig. 1D); dess armbåge roterar mot den klassiska 50s P-platsen, men dess acceptorände är bunden mellan 50s-underenheten A-och P-platserna (Fig. 1C), som bildar ett ap / ap-chimärt hybridtillstånd. Den stora, EF-G-beroende rotationen av 30s-huvudet i vår struktur omplacerar helix H38 av 23s rRNA, vilket gör att A-tRNA-armbågen når positionen för P-site tRNA-armbågen (Fig. S14). Domän IV av EF-G är inklämd i konvergensplatsen för a-site mRNA-kodonet, anticodon-slingan i ap / ap tRNA och 16s och 23s rRNAs vid intersubunit bridge B2a, samtidigt som de kontaktar alla fyra rna (Fig. S15).
(a) 70s ribosom med tRNA bundna i klassiska A/A-och P/p-tillstånd (17); (B) translokation mellankomplex, som visar tRNA fångade i mellanliggande chimära hybrid ap/ap och pe/e-tillstånd. (C) jämförelse av tRNA-positioner i klassiska tillstånd och i translokationsmellanprodukten, inriktad på 50s-underenheten; (D) relativa positioner för tRNA-ASL, inriktad på 30s-underenhetskroppen eller (E) huvudet. Molekylära komponenter är färgade genomgående som: 16S rRNA, cyan; 30s proteiner, blå; 23S rRNA, grå; 5S rRNA, ljusblå; 50S proteiner, magenta; mRNA, grön; a/a och ap/ap tRNA, gul; P/p och pe / e tRNA, röd; EF-G, orange.
(A-B) tRNAs positioner i (A) klassisk-statlig ribosom och (B) translokation mellanprodukt. (C–D) interaktioner mellan tRNA ASLs och mRNA när de flyttar från (C) A och p klassiska tillstånd till (D) ap och pe chimära hybridtillstånd. (E–F) omläggning av 966-slingan (h31) av 16S rRNA i 30s-underenhetshuvudet från dess (e) klassiska P-tRNA-bindande läge till (F) bildar en ytmonterad ficka runt ap/ap tRNA ASL.
Även om 30s-huvudrotation tydligt underlättar P-site ASL-translokation (9-11) translokeras a-site ASL av en annan mekanism. P-site ASL rör sig exakt med 30s-huvudrotation i pe / E-tillståndet, medan a-site ASL har rört sig längre än huvudets rotationsrörelse till ap-tillståndet på 30s-underenheten (Fig. 1E). Förflyttning av a-site ASL exakt med huvudrotation skulle resultera i allvarlig kollision med domän IV av EF-G eftersom den är placerad i vårt komplex, vilket tillsammans med kontakten som bildas mellan spetsen av domän IV och kodon-antikodon-spiralen i ap/ap tRNA (Fig S16) antyder att rörelse av mRNA och ASL är kopplade till domän IV. den ytterligare förskjutningen av ap/ap ASL bringar den nära pe/E ASL (Fig. 2C, D) (11). Huvudets position kan stabiliseras genom interaktion mellan fosfat 1210 av 16s rRNA med domän IV av EF-G vid Gly531.
mest slående är omarrangemanget av 16S rRNA 966-slingan i 30s-huvudet, som bryter bort från P-platsen för att nå mot A-platsen, där den initierar kontakt med den delvis translokerade ap/ap-ASL (Fig. 2E, F). Denna omläggning innebär störning av förpackningen av m22G966 mot ribos 34 på P-plats ASL (18, 19) och bildning av en ytmonterad ficka runt ap/ap-ASL med nukleotiderna a965, m22G966 och C1400. I en kristallstruktur av motsvarande enkel-tRNA-komplex (10) (Fig. S6), pe/e tRNA ASL befanns upprätthålla alla kanoniska p-site-kontakter med 30s-huvudet, inklusive 966-slingan, när den roterar mot e-platsen. I det två-tRNA-komplex som rapporteras här upprätthålls emellertid endast en deluppsättning av p-site 30S-huvudinteraktionerna med pe/E ASL, vilket involverar G1338, a1339, a1340 och C-terminal svans av protein uS9. Bildandet av interaktioner efter translokation samtidigt med störning av interaktioner före translokation, föreslår en mekanism för hur ASL: erna överlämnas mellan A-och P-platserna. Det kan också representera ett första skift i kontakter som måste störas för att frigöra pe/E tRNA ASL före bakrotation av 30s-huvudet i de sista stadierna av translokation (20, 21).
nätverket av interaktioner som bildas mellan den konserverade slingan 1 (rester 499-504) i domän IV av EF-G, ap/ap ASL och dess mRNA-kodon (Fig. S15) (11) liknar de som observerats i post-translokationstillståndet (15), vilket tyder på att de upprätthålls under hela translokationscykeln. Deras likhet med de mindre spårinteraktioner som gjorts av A1492 och a1493 med kodon-antikodon-spiralen i avkodningsstället (22) antyder att de kan bidra till att upprätthålla korrekt kodon-antikodon-parning under rörelse mellan A-och P-platserna (15) och överensstämmer med förslaget att EF-G underlättar translokation genom att destabilisera interaktioner i 30s-avkodningsstället (23).
interaktioner mellan mRNA och element i 30s-huvudet i nedströms mRNA-ingångstunneln har föreslagits för att bära mRNA framåt med tRNA under huvudrotation (17). Det är emellertid inte klart att mRNA: s nettorörelse kan upprätthållas på detta sätt, eftersom dessa interaktioner störs under huvudrotation. Vi finner att den förlängda svansen av mRNA, som den framträder från nedströms tunneln, böjer sig uppåt för att binda till ytan av protein uS3 i underenhetens Huvud (Fig. 3, S17). Således skulle framåtriktad huvudrotation aktivt flytta mRNA i riktning mot translokation. Jämförelse av positionen för en referensnukleotid på mRNA i de roterade och icke-roterade tillstånden visar vidare att framåtriktad huvudrotation skulle förflytta mRNA med ett kodon (Fig. 3D), som stöder möjligheten att mRNA aktivt flyttas av ribosomen under translokation. Eftersom dimensionerna av nedströmstunneln utesluter inträde av en RNA-helix, störning av mRNA-sekundär struktur av ribosomalhelikas (24) måste ske vid eller nära ingången till tunneln, genom interaktion med ribosomen utanför tunneln. Bindning av mRNA-svansen som omedelbart flankerar ingången till tunneln uteslutande till 30-talets huvud ger en sådan interaktion. Krafterna som skapas genom huvudrotation kan således destabilisera basparning i spiralformiga element av mRNA när de kommer in i nedströms tunneln.
(a) ingången till nedströms mRNA-ingångstunneln omges av proteiner uS3, uS4 och uS5. Positionerna +14 till + 21 kommer i kontakt med en positivt laddad lapp på ytan av proteinet uS3 i 30s-huvudet (Fig. S17). (B) banan för nedströms mRNA och (C) 90 oz. (D) dockning på 30s-kroppen i den klassiska strukturen (17) (grå) visar att rotation av huvudet i ap/ap-mellanstrukturen translokerar mRNA med ett kodon. A-kodon (gul) och P-kodon (röd).
i det klassiska tillståndet bildar C74 och C75 i cca-svansen på P-site tRNA baspar med G2252 respektive G2251 i P-slingan (H80) på 23s rRNA, medan C75 i a-site tRNA-paren med G2553 i a-slingan (H92) (18, 25, 26). Dessa interaktioner placerar peptidyl-och aminoacyldelarna för peptidyltransferasreaktionen (27), som lämnar ett deacylerat tRNA på P-stället och ett peptidyltrna på A-stället. Ett kritiskt steg i translokation är därför den efterföljande rörelsen av peptidyl-CCA-änden från A-slingan till P-slingan. Strukturen för translokationsmellanprodukten avslöjar ett chimärt tillstånd, som skiljer sig från de tidigare beskrivna (Fig. S18), i vilken acceptoränden av peptidyl-tRNA interagerar samtidigt med både A-och P-slingorna (Fig 4). I detta tillstånd bevaras basparning av C75 med G2553 av a-slingan, medan rörelse av dess acceptorstam till en position nära den för klassisk P-plats tRNA tillåter G2252 och G2253 i en omarrangerad P-slinga för att kontakta tRNA-ryggraden vid positionerna 72 och 70 (Fig. 4B). Således är änden av acceptorstammen av ap/ap-tRNA förankrad på P-slingan, vilket underlättar överföring av dess intilliggande C74-och C75-rester från A-slingan till P-slingan. A76 av ap / ap tRNA är orienterad på samma sätt som den som observerats för tRNA bunden i P / P klassiskt tillstånd (17), med sin n-acetyl-valin peptidyldel placerad vid ingången till peptidutgångstunneln, medan C74 och C75 upprätthåller sina interaktioner med A-slingan av 23s rRNA (Fig. 4, S19).
under translokation flyttar 3′ acceptoränden av peptidyl-tRNA från det (A) klassiska A/A-tillståndet till (B) mellanliggande ap/ap-tillståndet till (C) klassiska P/P-tillstånd, underlättat av konformationsförändringar i A-och P-slingorna.
ap / ap-tRNA kan motsvara mellanliggande tillstånd som har karakteriserats kinetiskt. Fluorescence quenching kinetic studier identifierade en EF-G-beroende intermediär (INT) i vilken peptidyl-tRNA-armbågen rör sig från A-platsen mot P-platsen, men förblir endast delvis reaktiv med aminoacyl-tRNA-mimic putromycin, vilket tyder på att dess CCA-ände inte är helt inrymd i P-platsen (28). Kinetiska studier där en sond fästes direkt till peptidyl-tRNA CCA-änden, identifierade EF-G-beroende translokationsmellanprodukter där acceptoränden av peptidyl-tRNA rör sig mot p-platsen, men förblir puromycin-oreaktiv (29). Egenskaperna hos dessa mellanprodukter är kompatibla med det fångade ap/ap-tillståndet som observeras här. Strukturen för denna fångade translokation mellanprodukt börjar beskriva hur tRNA rör sig mellan de ribosomala A-och P-platserna. TRNA-bindningsställena själva är dynamiska och bildar samtidiga kontakter mellan A-tRNA och element i både A-och P-platserna, som liknar stafettpinnen i ett relä (30). Detta ses för både 30-och 50-talets underenheter. I 30s-underenheten släpper omarrangemanget av 966-slingan på 16s rRNA G966 från P-platsen ASL för att kontakta a-platsen ASL när den rör sig in i 30S P-platsen (Fig. 2E, F). I 50-talets underenhet omarrangeras A-och P-slingorna på 23s rRNA för att tillåta båda slingorna att kontakta 3′ – acceptoränden på a-site tRNA när den börjar sin övergång till 50s P-platsen (Fig. 4). Dessa fynd visar att den strukturella dynamiken hos ribosomalt RNA spelar en aktiv roll i translokationsmekanismen.