Robert De Niro Sr. föddes i Syracuse, New York, till en irländsk-amerikansk mamma, Helen M. (N jacobe O ’ Reilly; 1899-1999). Helens mor var Mary E. Burns (född till John och Mary Burns) och hennes far var Dennis Francis O ’Reilly, född till Dundrum’ s Ellen Hall, Edward O ’ Reillys andra fru. Det fanns tidigare förvirring om Dennis Moderskap, hans mor trodde tidigare att han var Edwards andra fru Margaret.Roberts italiensk-amerikanska far, Henry Martin De Niro (1897-1976), föddes till föräldrar som emigrerade från Ferrazzano 1887, Angelina Mercurio och Giovanni Di Niro.Robert var den äldsta av tre barn; han och syskonen John och Joan växte upp i Syracuse, New York. De Niro studerade vid den berömda Black Mountain College under Josef Albers från 1939 till 1940. Medan Albers mycket analytiska inställning till målning inte vädjade till De Niros mer instinktiva stil, lämnade Bauhaus-mästarens erfarenhet och internationella perspektiv ändå ett bestående intryck. De Niro studerade med Hans Hofmann på sin Provincetown, Massachusetts sommarskola. Hofmanns undervisning om abstrakt Expressionism och kubistisk formalism hade ett starkt inflytande på De Niros utveckling som Mogen konstnär.
på Hofmanns sommarskola träffade han medstudenten Virginia Admiral, som han gifte sig med 1942. Paret flyttade in i ett stort, luftigt loft i New Yorks Greenwich Village, där de kunde måla. De omringade sig med en berömd vänkrets, inklusive författare Ana asis Nin och Henry Miller, dramatiker Tennessee Williams, och skådespelerskan och den berömda Berlin-dansaren Valeska Gert. Amiral och De Niro separerade strax efter att deras son Robert De Niro Jr.föddes i augusti 1943 efter att De Niro kom ut som gay. 1944 hade De Niro ett förhållande med poeten Robert Duncan.
Efter att ha studerat med Hans Hofmann i New York och Provincetown och Josef Albers vid Black Mountain College, North Carolina i slutet av 1930-talet och början av 1940-talet arbetade De Niro i fem år på Hilla Rebays legendariska Museum of Non-Objective Art. 1945 ingick han i en gruppshow på Peggy Guggenheims Art of This Century i New York, som var ett ledande galleri för konsten för både etablerade europeiska modernister och medlemmar i den framväxande abstrakta Expressionistgruppen som Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell och Clyfford Still. De Niro hade sin första separatutställning på Guggenheims galleri i April och maj året därpå. Vid den tiden arbetade han främst på ett abstrakt sätt, ofta med figurativa referenser. Mycket av hans arbete från denna period förlorades i en studiobrand 1949.
De Niro hade en serie separatutställningar på 1950-talet på Charles Egan Gallery i New York, som ställde ut Willem de Koonings och andra tidiga abstrakta expressionistiska konstnärer. Kritiker berömde Deniros kompositioner fyllda med improviserade områden med livlig färg som gav plats för löst målade stilleben och kurviga nakenbilder. I mitten av 1950-talet ingick De Niro regelbundet i viktiga grupputställningar som Whitney Annual, The Stable Annual och The Jewish Museum. Han tilldelades en Longview Foundation award 1958.
från 1961 till 1964 reste De Niro till Frankrike för att måla i Paris och på den omgivande landsbygden. Samlaren Joseph Hirshhorn köpte ett antal av konstnärens målningar och arbetar på papper under denna period genom De Niros gallerist, Virginia Zabriskie, som nu finns i den permanenta samlingen av Hirshhorn Museum and Sculpture Garden i Washington, DC. 1968 tilldelades han ett Guggenheim-stipendium.