Einführung
Kcat ist die Umsatzzahl – die Anzahl der Substratmoleküle, die jede Enzymstelle pro Zeiteinheit in Produkt umwandelt. Wenn Sie die Konzentration von Enzymstellen kennen, können Sie Kcat anstelle von Vmax anpassen, wenn Sie eine Substrat-Geschwindigkeits-Kurve analysieren.
Das Modell
Y = Et*kcat*X/(Km + X)
X ist die Substratkonzentration.
Y ist die Enzymgeschwindigkeit.
kcat ist die Umsatzzahl, die Anzahl, wie oft jede Enzymstelle Substrat pro Zeiteinheit in Produkt umwandelt. Dies wird in der Umkehrung der Zeiteinheiten der Y-Achse ausgedrückt. Wenn Y beispielsweise in Mikromol Substrat pro Minute angegeben ist, ist kcat die Anzahl der pro katalytischer Stelle pro Minute erzeugten Substratmoleküle. Km ist die Michaelis-Menten-Konstante in den gleichen Einheiten wie X. Es ist die Substratkonzentration, die benötigt wird, um eine halbmaximale Enzymgeschwindigkeit zu erreichen.
Et ist die Konzentration von enzymkatalytischen Stellen. Wenn das Enzym mehrere Untereinheiten aufweist, beachten Sie, dass Et die Konzentration katalytischer Stellen ist, die größer sein kann als die Konzentration von Enzymmolekülen. Die von Ihnen eingegebenen Y-Werte sind Enzymgeschwindigkeiten, die in Konzentrationseinheiten pro Zeit eingegeben werden. Et muss in denselben Konzentrationseinheiten eingegeben werden (während die Zeiteinheiten durch kcat definiert sind).
Vmax ist die maximale Enzymgeschwindigkeit in den gleichen Einheiten wie Y. Sie wird im obigen Modell nicht direkt angezeigt. Es ist die Geschwindigkeit des Enzyms extrapoliert auf sehr hohe Konzentrationen von Substrat, so ist fast immer höher als jede Geschwindigkeit in Ihrem Experiment gemessen. Es wird berechnet, indem Et mal kcat multipliziert wird.
Beziehung zum Michaelis-Menten-Modell
Die oben gezeigte Kurve ist identisch mit der vom Michaelis-Menten-Modell definierten Kurve. Sie erhalten identische Kurven, wenn Sie beide Modelle an Ihre Daten anpassen, und identische Werte für Km.
Das Michaelis-Menten-Modell findet die Vmax, die maximale Enzymgeschwindigkeit, die auf sehr hohe Substratkonzentrationen extrapoliert wird. Es wird in den gleichen Einheiten ausgedrückt, die Sie zur Eingabe Ihrer Y-Werte (Enzymaktivität) verwendet haben. Normalerweise ist es einfach, dies auszudrücken (oder in Mol / Minute / mg Protein umzuwandeln). Die Vmax wird dadurch bestimmt, wie viele Enzymstellen vorhanden sind (Et) und mit welcher Geschwindigkeit das Enzym Substrat in Produkt umwandeln kann (kcat).
Wenn Sie die Konzentration der Enzymstellen kennen, die Sie dem Assay (Et) hinzugefügt haben, können Sie die katalytische Konstante Kcat mit dem obigen Modell anpassen.
Bei der Berechnung von Kcat heben sich die Konzentrationseinheiten auf, sodass Kcat in Einheiten der inversen Zeit ausgedrückt wird. Es ist die Umsatzzahl – die Anzahl der Substratmoleküle, die jede Enzymstelle pro Zeiteinheit in Produkt umwandelt.
Modell mit Prisma bestücken
1.Erstellen Sie eine XY-Datentabelle. Geben Sie die Substratkonzentration in X und die Enzymgeschwindigkeit in Y ein. Wenn Sie mehrere Versuchsbedingungen haben, platzieren Sie die erste in Spalte A, die zweite in Spalte B usw. Sie können auch Prisms Beispieldaten auswählen: Enzymkinetik — Michaelis-Menten.
2.Klicken Sie nach der Eingabe der Daten auf Analysieren, wählen Sie nichtlineare Regression, wählen Sie das Feld Enzymkinetikgleichungen und wählen Sie Kcat.
3.Sie müssen Et basierend auf anderen Experimenten auf einen konstanten Wert beschränken. Um den Wert von Et einzuschränken, gehen Sie zur Registerkarte „Einschränken“ des Dialogfelds „nichtlineare Regression“, stellen Sie sicher, dass das Dropdown-Menü neben Et auf „Konstant gleich“ gesetzt ist, und geben Sie den Wert ein. Geben Sie für die Beispieldaten 100 als Wert von Et ein.
Wenn Sie den Wert von Et nicht kennen, können Sie den kcat nicht anpassen, sondern sollten stattdessen den Vmax . Es ist nicht möglich, dass Prism sowohl kcat als auch Et anpasst, da die beiden Parameter miteinander verflochten sind und eine Substrat-Geschwindigkeits-Kurve keine Informationen über ihre einzelnen Werte gibt.
4.Mit den Stichprobendaten berichtet Prism, dass Km = 5.886 mit einem 95% -Konfidenzintervall von 3.933 bis 7.839. Der beste Anpassungswert von kcat ist 13,53 mit einem 95% -Konfidenzintervall von 11,97 bis 15,09.
Anmerkungen
•Siehe die Liste der Annahmen aller Analysen der Enzymkinetik.
•Diese Gleichung passt genau die gleiche Kurve wie die Gleichung, die Vmax passt, anstatt die Umsatzzahl Kcat. Das Produkt von Kcat mal Et (die Konzentration der Enzymstellen) entspricht dem Vmax.
•Diese Gleichung bezieht sich auf die Gleichung für allosterische Enzyme. Dieses allosterische Modell fügt einen zusätzlichen Parameter hinzu: die Hügelneigung h. Wenn h gleich 1,0 ist, sind die beiden Modelle identisch.