Identifizierung von Bordetella pertussis bei einem kritisch kranken Patienten mit humanem Immundefizienzvirus durch direkte genotypische Analyse von Gram-gefärbtem Material und Diskriminierung von B. holmesii unter Verwendung einer einzigartigen recA-Genrestriktionsenzymstelle

Die Identifizierung von Bakterien aus klinischen Proben erfolgt weitgehend über phänotypische Charakterisierung nach In-vitro-Kultur und Mikroskopie. Nicht selten zeigen direkte Gram-gefärbte Präparate jedoch viele Organismen, während Kulturen keinen Erreger nachweisen können. Dies wurde kürzlich in einem klinischen Fall veranschaulicht, in dem ein 48-jähriger Mann mit AIDS mit pulmonaler Kokzidioidomykose aufgenommen wurde. Trotz antimykotischer Therapie konnte sich sein Status nicht verbessern. Sputumproben zeigten viele gramnegative Bazillen auf direkte Mikroskopie, aber keine Krankheitserreger auf Kultur. Darüber hinaus wuchsen in mehreren Blutkulturen anspruchsvolle gramnegative Stäbchen, die mit herkömmlichen Methoden nicht spezifiziert werden konnten.

Wir haben uns entschlossen, die Identifizierung der beiden Isolate durch genotypische Methoden unter Verwendung universeller Oligonukleotidprimer zu versuchen, die auf das Gen der kleinen Untereinheit rRNA (16S rRNA) abzielen. Von den respiratorischen Proben standen jedoch nur Gram-gefärbte Objektträger zur Verfügung. Wir haben daher eine neue Methode entwickelt, bei der bakterielle DNA direkt aus dem Gram-gefärbten Objektträger gewonnen wird. Die Objektträger wurden nach traditioneller Methode gramgefärbt (12). Ein Klarglasobjektträger wurde mit Proben bestrichen und mit absolutem Methanol behandelt (Mallinckrodt, Hazelwood, Mo.), gefolgt von Hitzefixierung bei 65°C und Behandlung mit Kristallviolettlösung (Remel, Lenexa, Kans.). Der Objektträger wurde weiter mit Gram’schem Jod (Remel) behandelt, mit Alkohol-Aceton-Lösung (3:1) entfärbt und mit Safranin (Remel) gegengefärbt. Immersionsöl wurde zuerst mit 100% igem Xylol (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) vom Objektträger entfernt und anschließend in 100% igem Ethanol gespült. Dann wurde das Material mit einer Rasierklinge verschrottet, suspendiert in 50 µl Puregene-DNA-Hydratationslösung (Gentra, Minneapolis, Minn.), vortexiert und 10 min. gekocht. Zur Analyse des Blutisolats wurde Material sowohl aus der BACTEC-Flasche als auch aus auf festem Medium gewachsenen Kolonien verwendet. Die anschließende PCR wurde in einem Volumen von 50 µl durchgeführt, das 5 µl der Vorlage, 1,5 mM MgCl 2, je 100 µM Desoxynukleosidtriphosphat enthielt (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind.), 1 U Taq-DNA-Polymerase (Roche Diagnostics Corporation) und je 0,15 µM universelle 16S-rRNA-Primer 11E (5′-GAGGAAGGTGGGGATGACG-3′) und 13B (5′-TCCGGGCCCTTGCATAAGTG-3′) wie zuvor beschrieben (15). Nach einem Denaturierungsschritt von 5 min bei 94°C wurden PCR-Schritte von 94°C für 60 s, 50°C für 60 s und 72°C für 90 s in einem Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Produkte wurden sowohl aus Sputum als auch aus Blut erhalten (Abb. 1). Diese wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Inc., Valencia, Calif.Die DNA-Sequenzierung wurde an einem Applied Biosystems ABI3100-Sequenzer (HHMI Biopolymer / W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University School of Medicine) durchgeführt. Der anschließende Vergleich mit der öffentlichen Datenbank (GenBank) durch BLAST (1) identifizierte das Blutisolat als Helicobacter cinaedi oder Helicobacter rappini. Beide Organismen wurden bei immungeschwächten Patienten mit Bakteriämien in Verbindung gebracht (9, 10, 13, 16, 17). Das PCR-Produkt des respiratorischen Isolats passte zu den 16S-rRNA-Genen von Bordetella pertussis und Bordetella holmesii, die im amplifizierten Bereich zu 99,5% homolog und identisch sind (18).

Um das Bordetella-respiratorische Isolat zu spezifizieren und das Ergebnis der genotypischen Analyse zu validieren, wurde ein diskriminierender Assay entwickelt, bei dem ein Teil des recA-Gens (6, 7), der eine einzigartige Restriktionsenzymstelle enthält, gezielt wurde. Amplifikation von B. pertussis (ATCC 9340; American Type Culture Collection, Manassas, Va.) und B. holmesii (ATCC 51541) DNA sowie die aus dem Sputum unseres Patienten Gram-Färbung wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 3 mM MgCl2 und neu entwickelte spezifische Primer (forward, 5′-CAATACGCCTCCAAGCTGGG-3′; und umgekehrt, 5′-TGATGTCGAACTCGGCCTGC-3′) verwendet und die PCR-Schritte (94 °C für 30 s, 59 °C für 30 s und 72°C für 60 s) wurden 45 mal wiederholt, gefolgt von einem abschließenden Dehnungsschritt bei 72 °C. Die Produkte wurden mit NciI gemäß den Empfehlungen des Herstellers (New England Biolabs, Inc., Beverly, Masse.). Die beiden Organismen konnten leicht unterschieden werden, da B. holmesii zwei NciI-Stellen hat, während B. pertussis und alle anderen Bordetella spp. haben Sie nur eine NciI-Stelle innerhalb der amplifizierten Region. Das Sputumisolat wurde anschließend als B. pertussis identifiziert (Abb. 2) und wurde als opportunistischer Lungenpathogen bei mit dem humanen Immundefizienzvirus infizierten Patienten berichtet (4, 5).

Als nächstes untersuchten wir, ob die genotypische Identifizierung von Organismen direkt aus klinischen Gramfärbemitteln mit Universalprimern eine praktikable und reproduzierbare Methode ist. Die Art der Fixierung (Hitze, 100% Methanol und 100% Ethanol) und das Vorhandensein von Farbstoffresten nach der oben beschriebenen Gram-Färbung stören die PCR nicht. Es wurde eine Nachweisgrenze von 1.500 KBE / µl Sputum (6 bis 30 Organismen pro Ölimmersionsfeld) gefunden, die anderen Berichten ähnelt (14). Für diesen Befund wurden drei randomisierte klinische Sputumproben ohne Bakterien auf Gram-Färbung oder in Kultur gepoolt, mit definierten Mengen an Escherichia coli (ATCC 25922) versetzt, fixiert und Gram-gefärbt und wie oben beschrieben vom Objektträger abgekratzt. Mehrere zufällig ausgewählte klinische Proben wurden getestet, und wenn ein vorherrschender Organismus mikroskopisch sichtbar war, stimmte seine Identifizierung mit dem kultivierten Erreger überein (Tabelle 1).

Unsere Methode hat mehrere Vorteile gegenüber früher beschriebenen Assays. Im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen DNA zuerst aus Sputum extrahiert und artenspezifische Primer verwendet werden (2, 11, 14, 19, 20), unser Assay verwendet DNA, die direkt von Gram-gefärbten Objektträgern ohne Extraktionsschritte gewonnen wurde, und verwendet universelle Primer, wodurch die Identifizierung einer breiten Palette von Bakterien mit einem einfachen Protokoll ermöglicht wird. Wie gezeigt, kann dies sogar in Gegenwart einer normalen Hintergrundflora erreicht werden, da die Anzahl der PCR-Zyklen begrenzt ist, wodurch eine kompetitive Amplifikation der bakteriellen DNA ermöglicht wird. Da die Qualität der vorgelegten Probe und die relativen Anteile morphologisch unterschiedlicher Mikroben an Gram-Färbungen leicht bestimmt werden können, können geeignete Abstriche vor der DNA-Amplifikation ausgewählt werden. Darüber hinaus dient die Gramfärbung des vorherrschenden Organismus als interne Qualitätskontrolle nach genotypischer Identifizierung. Wie bei der phänotypischen Identifizierung müssen die Ergebnisse unseres Assays mit dem Krankheitsbild korreliert werden, bevor Behandlungsentscheidungen getroffen werden, da keine der beiden Methoden zuverlässig zwischen Besiedlung und Infektion unterscheiden kann.

Unter den wenigen Berichten in der englischsprachigen Literatur, die die Gewinnung von Nukleinsäure aus klinischen Proben auf Objektträgern beschreiben (3, 8), hat bisher keiner die DNA-Amplifikation nach der Gewinnung von Bakterien aus Gram-gefärbten Objektträgern beschrieben. Unsere Methode ist schnell und zuverlässig und kann als Werkzeug in Fällen verwendet werden, in denen Organismen auf klinischen Gram-gefärbten Objektträgern in Hülle und Fülle zu sehen sind, in Kultur jedoch nicht wiederhergestellt werden können. Die Technik kann besonders nützlich sein, wenn eine Diagnose retrospektiv gesucht wird oder nachdem die Originalproben verworfen wurden.

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