Jackson begann 1991 in einer kleinen Rolle in dem Film Crooked Hearts zu spielen. Im nächsten Jahr spielte er die Rolle von Charlie in einer musikalischen Version von Willie Wonka und the Chocolate Factory. Zu diesem Zeitpunkt trat er mit Hilfe der Casting-Direktorin des Stücks, Laura Kennedy, der Agentur William Morris bei. Bald darauf landete er die Rolle des Charlie (# 96) in der Mighty Ducks-Serie und spielte einen jungen und aufstrebenden Hockeyspieler.Joshua Jackson trat als Pacey Witter in Dawson’s Creek auf, das von Kevin Williamson kreiert wurde und von 1998 bis 2003 im WB-Netzwerk lief, und spielte auch James Van Der Beek, Michelle Williams und Katie Holmes. Während der Pause der Show trat er in mehreren Filmen auf, darunter Cruel Intentions (eine New Yorker Yuppie-Adaption von Les Liaisons Dangereuses, in der auch Sarah Michelle Gellar und Ryan Phillippe die Hauptrolle spielten), The Skulls, The Safety of Objects, The Laramie Project und ein kurzer Cameo-Auftritt im Remake von Ocean’s Eleven, in dem er unter anderem als er selbst in einer Pokerszene mit Brad Pitt, George Clooney und Holly Marie Combs auftritt. Im Jahr 2000 gastierte er auch in Staffel 12 der Simpsons und sprach den Charakter von Jesse Grass, einem „hunky Environmentalist“ und Liebesinteresse für Lisa Simpson in der Episode „Lisa the Tree Hugger“. Er wurde auch als „Beau“ in dem Film Gossip im Jahr 2000 mit den Schauspielern James Marsden, Kate Hudson und Norman Reedus besetzt.Kurz nach dem Ende von Dawson’s Creek im Jahr 2003 spielte Jackson die Hauptrolle in Filmen neben Dennis Hopper (Americano), Harvey Keitel (Shadows in the Sun) und Donald Sutherland (Aurora Borealis). Im Jahr 2005 zog Jackson nach Großbritannien und gab sein Bühnendebüt am Londoner West End mit Patrick Stewart in David Mamets Zwei-Mann-Stück A Life in the Theatre. Das Stück war ein kritischer und populärer Erfolg und lief von Februar bis April dieses Jahres. Jackson sagte, dass er erwägen würde, auf die Bühne zurückzukehren, um sich am Broadway zu versuchen. Seine nächste Filmrolle war in Bobby unter der Regie von Emilio Estevez, Jacksons Co-Star von The Mighty Ducks. Er spielte eine Hauptrolle in Shutter, einem US-Remake eines gleichnamigen thailändischen Horrorfilms. Er spielte und fungierte als ausführender Produzent in dem kanadischen Independent-Film One Week, der am 6. März 2009 eröffnet wurde.Von 2008 bis 2013 spielte Jackson die Hauptrolle von Peter Bishop in der Science-Fiction-Serie Fringe von JJ Abrams, Roberto Orci und Alex Kurtzman. Die Serie erschien im Fox TV Network und war die zweithöchste bewertete neue Show der Saison 2008-2009 nach CBS’s The Mentalist. BuddyTV rangierte ihn auf Platz 9 seiner „TV’s 100 Sexiest Men of 2010“ Liste, # 19 im Jahr 2011 und # 14 im Jahr 2012.
Jackson wurde für den Genie Award für die beste Leistung eines Schauspielers in einer Hauptrolle für den Film One Week nominiert. Er gewann den Preis am 12.April 2010. Er hielt und moderierte die satirische Pacey-Con im Jahr 2010, direkt gegenüber der San Diego Comic-Con, trug ein Bowling-Shirt und verteilte Fanfiction, geschrieben von Dawson’s Creek-Fans, an diejenigen, die in der Comic-Con-Eingangslinie warteten. Das Filmmaterial der Veranstaltung wurde für ein Video mit dem Titel ‚Pacey-Con‘ aufgenommen, das er für Will Ferrells Funny or Die Celebrity Humor-Website drehte. Im Jahr 2013 erschien Jackson in dem IFC-Film unausweichlich mit Marisa Tomei und Alexander Siddig. Jackson schrieb die erste Geschichte aus der Comic-Trilogie Beyond the Fringe mit dem Titel „Peter and the Machine“. Jackson spielte in der erfolgreichen Showtime-Fernsehsendung The Affair, in der er Cole Lockhart spielte, den Protagonisten Ehemann der untreuen Alison Lockhart.Im März 2018 gab Jackson sein Theaterdebüt am Broadway, Children of a Lesser God, wo er James Leeds spielte, einen unkonventionellen Lehrer an der Schule für Gehörlose, der in eine konfliktreiche berufliche und romantische Beziehung mit einer ehemaligen gehörlosen Schülerin gerät, Sarah Norman (Lauren Ridloff). Das Stück lief bis Mai 2018.Im Jahr 2019 spielte Jackson als Verteidiger Mickey Joseph in der Netflix-Drama-Miniserie When They See Us.Im Jahr 2020 spielte Jackson zusammen mit Reese Witherspoon und Kerry Washington in Hulus Miniserie Little Fires Everywhere, die auf dem Roman von Celeste Ng basiert.
Jackson wurde in der Titelrolle in Dr. Death, basierend auf dem gleichnamigen Podcast, besetzt.