Ihr Berater sagt Ihnen, dass er möchte, dass Sie HPLC verwenden, um Ihre Verbindung zu analysieren. Sie wissen, dass Sie schon einmal von dieser Technik gehört haben, aber Sie können sich nicht erinnern, wofür HPLC steht, geschweige denn, wie Sie vorgehen sollen! Wir waren alle dort, und ich wette, Sie hätten sich gewünscht, Sie hätten in diesem Vortrag mehr Aufmerksamkeit geschenkt!
Keine Angst – in dieser Artikelserie werde ich Sie an die Leistungsfähigkeit der HPLC-Säule erinnern 🙂
In diesem ersten Artikel werde ich Sie durch das Prinzip der HPLC führen und Sie an ihre Verwendung erinnern – Sie werden in kürzester Zeit bereit für das Labor sein!
Wie funktioniert die HPLC?
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC ist ein langer Name für eine leistungsstarke Technik, die auf der einfachen Tatsache basiert, dass sich einzelne Verbindungen in Wasser unterschiedlich verhalten.
HPLC trennt und reinigt Verbindungen entsprechend ihrer Polarität oder ihrer Tendenz, Wasser zu mögen oder nicht zu mögen. Um die Polarität in einen Zusammenhang zu bringen, bedenken Sie, dass Öl eine unpolare Flüssigkeit ist, die sich nicht mit Wasser vermischt. Ethanol hingegen ist polar und vermischt sich, wie viele von Ihnen wissen, sehr gut mit Wasser (Wodka und Cola??).
Ich habe versucht, den gesamten Prozess in Abbildung 1 unten zu vereinfachen, aber schauen wir uns zuerst die Hauptkomponenten an, die an der HPLC beteiligt sind. Entschuldigung im Voraus für einige unvermeidliche Jargon!
Die Komponenten
Die HPLC-Säule
Dies wird auch als stationäre Phase bezeichnet. Dies ist das Arbeitspferd der HPLC-Maschine, wird aus einer Vielzahl von Substanzen (oft Kieselsäure) hergestellt und ist sehr kompakt in der Natur. Die Kieselsäurepartikel sind durch lange Kohlenstoffketten funktionalisiert. Die Kohlenstoffketten sind unpolar und daher wird die Säule umso unpolarer, je länger die Kette ist. Säulen, die 18-Kohlenstoffketten enthalten, werden üblicherweise verwendet und als C18-Säulen bezeichnet.
Die HPLC-Probe
Die Probentypen variieren stark je nach Feld und Art der betreffenden Verbindungen. HPLC kann verwendet werden, um Verbindungen in biologischen Proben (Urin, Blut, Speichel und Muskeln), Umweltproben, medizinischer Chemie (Arzneimittel) und Mikrobiologie (Toxine, die von Pilzen und Bakterien produziert werden) zu analysieren.
Injektion der Probe
Die Proben werden in die HPLC-Säule injiziert. Dies wurde früher manuell durchgeführt, was bedeutete, dass eine arme Seele stundenlang an der HPLC-Maschine sitzen und jede Probe mit einer Spritze injizieren musste, manchmal die ganze Nacht!Glücklicherweise verfügen neuere Modelle über einen automatischen Injektor, der die manuelle Eingabe reduziert und einen höheren Durchsatz ermöglicht. Moderne Maschinen sind mit einer Software ausgestattet, mit der der Benutzer eine Liste von Proben eingeben kann, wie viel und in welcher Reihenfolge sie injiziert werden sollen. So können Sie Ihr Mittagessen genießen, während Ihre HPLC selbst läuft!
Die mobile Phase
Dies ist wirklich nur eine Mischung aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel (normalerweise Acetonitril oder Methanol). Die mobile Phase erhält ihren Namen, weil sie sich durch die Säule bewegt und gleichzeitig die Verbindungen aus der Säule eluiert (oder ausspült).
Verbindungen werden oft entlang eines Konzentrationsgradienten eluiert. Wenn Sie so etwas wie ich sind, Konzentration und Steigung sind zwei Wörter, die Sie hassen, in einem Satz zusammenzukommen! Es bedeutet nur, dass der Prozentsatz an Wasser in der mobilen Phase mit der Zeit abnimmt, während der Prozentsatz des unpolaren Lösungsmittels gleichzeitig zunimmt. Dies bedeutet, dass die mobile Phase allmählich unpolarer wird. Machen Sie sich vorerst keine Sorgen über Farbverläufe, da diese in einem Folgeartikel erneut angezeigt werden.
Der HPLC-Lauf
HPLC kann in einer Reihe von Modi durchgeführt werden. Die am häufigsten verwendete Methode ist als Reversed-Phase (RP-HPLC) bekannt und das beschreibe ich hier. In diesem Modus werden Verbindungen getrennt, beginnend mit den polar und endend mit den unpolaren Verbindungen. Für alle Modi bewegt eine leistungsstarke Pumpe die Probe und die mobile Phase durch die Säule. Ein typischer Lauf kann zwischen 10 und 60 Minuten dauern.
Das Prinzip der HPLC – ein genauerer Blick
Nachdem Sie nun eine Vorstellung von den beteiligten Komponenten haben, gehen wir etwas detaillierter auf das Prinzip ein.
Ich habe oben erwähnt, dass HPLC Verbindungen aufgrund der Polarität trennt. Aber wie funktioniert das eigentlich? Englisch bitte! Wenn der Gradient einsetzt, nimmt die Lösungsmittelkonzentration zu, während die Wasserkonzentration abnimmt. Dadurch wird die mobile Phase immer unpolarer. Verbindungen, die in der Probe enthalten sind, haften an den Kohlenstoffketten in der Säule, wobei die unpolarsten Verbindungen am stärksten und die polarsten Verbindungen schwach haften.
Abbildung 1 zeigt, was mit einer Probe, die eine Mischung von Verbindungen enthält, nach der Injektion in die Säule passiert. Die Verbindungen binden an die Säule und werden zu unterschiedlichen Zeiten ausgespült, je nachdem, ob sie beim Durchpumpen eher an der Säule oder an der mobilen Phase haften bleiben. Die Zeit, die jede Verbindung aus der Säule eluiert (oder ausspült), wird als Retentionszeit (Rf) dieser Verbindung bezeichnet.
Abbildung 1: Das Prinzip der HPLC
Abbildung 1: In die HPLC-Säule (gesamter Zylinder) werden Verbindungen unterschiedlicher Polarität (angegeben als abdunkelnde Blautöne) injiziert. Die mobile Phase wird durch die Säule gepumpt, und die Zugabe von Lösungsmittel entlang eines Konzentrationsgradienten (als schwarze gepunktete Linie dargestellt) verringert kontinuierlich die Gesamtpolarität der mobilen Phase (Y-Achse). Verbindungen können entweder an der Säule oder an der mobilen Phase haften, je nachdem, wie polar sie sind. Verbindungen haften schließlich an der mobilen Phase, wenn ihre Polarität mit der der mobilen Phase übereinstimmt. Sie dissoziieren dann von der Säule und werden zu einem bestimmten Zeitpunkt (X-Achse) während des Laufs eluiert. Diese Zeit wird als Rf für diese Verbindung bezeichnet.
Die Ausgabe verstehen
Die Ausgabe oder die Ergebnisse eines HPLC-Laufs werden normalerweise als Chromatogramm betrachtet (Abbildung 2). Dies ist eine horizontale Reihe von Peaks, die Verbindungen darstellen, die aus der Säule mit unterschiedlichen Rf-Werten eluiert wurden. Moderne HPLC-Geräte sind häufig mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) gekoppelt, sodass der Benutzer das resultierende Chromatogramm getrennter Verbindungen in Wellenlängen von 190 nm bis 900 nm betrachten kann. Wenn die untersuchten Verbindungen bekannt sind, kann der Benutzer wählen, nur 1 oder einige ausgewählte Wellenlängen zu betrachten. Zum Beispiel kann Kokain bei 254 nm beobachtet werden.
Abbildung 2: Ein typisches HPLC-Chromatogramm
Abbildung 2: Dieses Chromatogramm zeigt die Trennung von Verbindungen aus einer chemischen Reaktion, und das Chromatogramm wird bei 254 nm betrachtet. Zwei Hauptpeaks treten bei 8,20 und 9 Minuten auf, was zwei Verbindungen mit diesen Retentionszeiten darstellt. Die Anzahl der Absorptionseinheiten (AU) wird auf der Y-Achse angezeigt, während die Zeit des Laufs auf der X-Achse angezeigt wird.
Anwendungen
In der Biologie und Medizin wird HPLC häufig als Analysewerkzeug verwendet, um biologische und Umweltproben auf das Vorhandensein oder Fehlen bekannter Verbindungen (z. B. Metaboliten, Arzneimittel, Toxine, Pestizide) zu untersuchen und kann bei der Identifizierung unbekannter Verbindungen helfen.
In der Chemie wird HPLC jedoch routinemäßig eingesetzt, um chemische Reaktionen zu überwachen und die Reinheit der Produkte zu bestimmen. Darüber hinaus kann das Verfahren der HPLC zur präparativen HPLC modifiziert werden, wodurch interessierende Verbindungen zur weiteren Verwendung gereinigt werden können.
HPLC kann zunächst als sehr kompliziert erscheinen, aber seien Sie versichert, genau wie die meisten anderen Labortechniken macht es viel mehr Sinn, wenn Sie es tatsächlich tun.
Bleiben Sie dran für meine Follow-up-Artikel in den kommenden Wochen, in denen ich einige Hinweise geben werde, wie Sie das Beste aus Ihrem HPLC-Lauf herausholen können, abhängig von Ihrem Forschungsziel, sowie objektiv diskutieren, wie HPLC kann in Ihrer Forschung verwendet werden.
Gibt es noch andere Aspekte dieser Technik, die Sie ausführlicher behandeln möchten? Wenn ja, würden wir uns freuen, von Ihnen zu hören!
Happy HPLC-ing 🙂
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