Es gibt oft viel Verwirrung über die Bedeutung von „Enzymeinheiten“, „Enzymaktivität“ und „spezifischer Enzymaktivität“. In diesem Handbuch werden diese Schlüsselkonzepte in einfachen Worten erläutert und das Design von Enzymtests sowie die Bedeutung des Betriebs im linearen Bereich erläutert. Wir berücksichtigen auch Standardkurven und ob Sie Konzentration oder absolute Produktmenge auf der x-Achse darstellen sollten. Einige Tipps zum Einrichten von Assay-Kontrollen und zum Subtrahieren von Leerzeichen werden erläutert. Abschließend erklären wir, wie Enzymaktivitätswerte berechnet werden, und geben einen einfachen Überblick über kinetische Gleichungen.
Definitionen von Enzymeinheiten
Die Enzymologie wäre weniger kompliziert, wenn alle dieselbe Einheitendefinition verwenden würden. Eine Standardeinheitsdefinition ist unten angegeben:
1 Einheit (U) ist die Menge an Enzym, die die Reaktion von 1 umol Substrat pro Minute katalysiert (Definition A).
In den meisten R&D-Einstellungen ist 1 umol Substrat tatsächlich ziemlich viel Material, und andere Definitionen können bevorzugt werden, um zu vermeiden, dass Mengen in Bruchteilen von Einheiten ausgedrückt werden. Die folgende nicht standardmäßige Definition wird üblicherweise verwendet:
1 Einheit (U) ist die Enzymmenge, die die Reaktion von 1 nmol Substrat pro Minute katalysiert (Definition B).
Beachten Sie, dass die Änderung der Definition eine tiefgreifende Auswirkung auf die angegebene Anzahl von Einheiten hat, d. h. 1 Einheit Enzym gemäß Definition A würde 1000 Einheiten gemäß Definition B entsprechen!
Sie können auch Enzymeinheiten sehen, die als Milli-Einheit (oder mU) ausgedrückt werden, was einfach ein Tausendstel einer Einheit bedeutet, unabhängig davon, wie die Einheit definiert wurde.Es ist klar, dass die tatsächliche Menge eines Enzyms in einem Röhrchen nicht einfach durch Ändern der Einheitendefinition geändert wird, aber beim Vergleich der Aktivitäten von Proben verschiedener Lieferanten ist Vorsicht geboten. Solange die Einheitendefinitionen zur Verfügung gestellt werden, können Sie die angegebene Anzahl von Einheiten in nmol pro min umwandeln, was eindeutig ist und gültige Vergleiche ermöglicht.Aus Gründen der Klarheit in Ihrer eigenen Arbeit können Sie es vorziehen, ’nmol pro Minute‘ (oder ‚umol pro Minute‘) zu verwenden, wenn jedoch eine ständige Wiederholung erforderlich ist, hat der viel kürzere Begriff ‚Einheit‘ eindeutig seine Reize.
Was ist ‚Enzymaktivität‘
Die Aktivität wird in Einheiten pro ml (U/ml) angegeben, mit anderen Worten nmol pro min pro ml (wenn Einheitendefinition B angenommen wurde). Somit unterliegen auch in Einheiten ausgedrückte Aktivitätswerte einer illusorischen 1000-fachen ‚Steigerung‘, wenn man von Einheitendefinition A zu Einheitendefinition B wechselt. Auch hier kann es keine Verwirrung geben, wenn die Aktivität in nmol pro min pro ml und nicht in Einheiten pro ml ausgedrückt wird.Da sich die Aktivität auf die Konzentration bezieht, folgt daraus, dass zwei Fläschchen Enzym die gleiche Anzahl von Einheiten (insgesamt) enthalten können, aber unterschiedliche Aktivitäten (Konzentrationen) haben.
Was ist spezifische Enzymaktivität?
Die spezifische Enzymaktivität (üblicherweise einfach als ’spezifische Aktivität‘ bezeichnet) ist die Anzahl der Enzymeinheiten pro ml geteilt durch die Proteinkonzentration in mg/ml. Spezifische Aktivitätswerte werden daher als Einheiten/ mg oder nmol / min / mg angegeben (wenn Einheitendefinition B angewendet wird).Die spezifische Aktivität ist ein wichtiges Maß für die Enzymreinheit, und die Werte für verschiedene Chargen eines reinen Enzyms sollten innerhalb des normalen experimentellen Fehlers gleich sein.Serielle Verdünnungen einer Enzymlösung haben unterschiedliche Enzymaktivitätswerte, aber identische spezifische Aktivitätswerte, da bei der Berechnung der spezifischen Aktivität der Zähler (Einheiten / ml) und der Nenner (mg / ml) gleichermaßen von der Probenverdünnung beeinflusst werden.
Obwohl sich die spezifische Aktivität stark von der Aktivität unterscheidet, ist die Berechnung der spezifischen Aktivität dennoch vom Aktivitätswert abhängig, und daher wird der angegebene spezifische Aktivitätswert auch von der Definition der Enzymeinheit abhängig sein. Chargen, die unter dem erwarteten spezifischen Aktivitätswert liegen, können Verunreinigungen oder Enzymmoleküle enthalten, die denaturiert sind.
Faktoren, die die Enzymaktivität beeinflussen
In diesem Abschnitt wird erläutert, warum ein Enzym in verschiedenen Labors unterschiedliche Aktivitätsmesswerte aufweisen kann. Damit meinen wir reale Unterschiede in der gemessenen Aktivität, nicht offensichtliche Unterschiede, die durch die Verwendung verschiedener Einheitendefinitionen verursacht werden.
Die Bedingungen, unter denen ein Assay durchgeführt wird, beeinflussen die gemeldeten Aktivitätswerte. Beispielsweise werden Assays typischerweise bei einer Temperatur zwischen 20-37 ° C durchgeführt. Im Allgemeinen ist ein Enzym bei 37 ° C aktiver als bei 20° C.
Die Definition der Enzymeinheit würde besser so ausgedrückt werden:
1 Einheit (U) ist die Menge an Enzym, die die Reaktion von 1 nmol Substrat pro Minute unter Standardbedingungen katalysiert.
Leider kann der Begriff „Standardbedingungen“ interpretiert werden, und es kann unterschiedliche Benutzereinstellungen geben, zumindest in R&D-Umgebungen. So können zehn verschiedene Forschungslabore (ganz richtig) unterschiedliche Aktivitäten für dieselbe Enzymlösung berechnen. Die meisten Forschungslabore legen ihre eigenen Standardbedingungen fest und überprüfen jede neue Charge intern. In klinischen Umgebungen werden ‚Standardbedingungen‘ explizit definiert und alle Labore müssen identische Assays durchführen.
Entwicklung von Assays und die Bedeutung des linearen Bereichs
Der Aktivitätswert (Einheiten/ml) für Ihr Enzym ist der wichtigste Parameter bei der Entwicklung eines Assays. Dies liegt daran, dass das Volumen (d. H. Die Anzahl der Einheiten), die Sie hinzufügen, die Menge an Substrat bestimmt, die in Produkt umgewandelt wird. Denken Sie daran, 1 Einheit katalysiert die Umwandlung von 1 nmol Substrat pro Minute (Definition B).Da der Aktivitätswert jedoch möglicherweise nicht in einem mit Ihrem Test identischen Test bestimmt wurde, ist es üblich, serielle Verdünnungen des Enzyms herzustellen (z. B. log-Verdünnungen) zunächst) und ein festes Volumen jeder Verdünnung zu testen. Abhängig vom Assay-Signal (das sich auf die Menge des umgewandelten Substrats bezieht) kann ein zweites Experiment erforderlich sein, um eine geeignete Verdünnung zu bestimmen.
Was genau ist die ‚beste‘ Verdünnung? Um dies zu beantworten, müssen wir über den wichtigsten Aspekt des Assay-Designs nachdenken – den linearen Bereich. Für quantitative Arbeiten ist es wichtig, in einem Bereich zu arbeiten, in dem eine Darstellung des Assaysignals (häufig Absorption) gegenüber der Enzymkonzentration linear ist. Die meisten Assays sind linear, wenn der Grad der Substratumwandlung weniger als 15% beträgt, vorausgesetzt, es gibt keine anderen begrenzenden Faktoren. Durch Festlegen der Assayzeit (z. B. 30 min) und der Temperatur (z. B. 25oC) kann der Umwandlungsgrad einfach durch Einstellen eines Parameters, d. H. der Anzahl der hinzugefügten Enzymeinheiten, gesteuert werden.
Dies wird grafisch in Abbildung 1 mit Verdünnungen dargestellt, die als Kehrwerte ausgedrückt werden (d. h. Verdünnung von 1/10 = 0,1 auf der x-Achse). Ihr eigenes Diagramm kann sich in Form und linearem Bereich unterscheiden, aber bei sehr hohen Enzymkonzentrationen steigt das Assaysignal nicht proportional zur zugesetzten Enzymmenge an.
Der Assay in Abbildung 1 ist linear bis zu einer optischen Dichte (OD) von 2,5 und ein Verdünnungsfaktor von 0,02 (1/50 Verdünnung des Enzyms) wäre ideal für Assay-Arbeiten, da er ein großes Signal (~ 1,5) liefert und in der Mitte des linearen Bereichs liegt. Berechnungen, die auf Ergebnissen für Verdünnungsfaktoren im Bereich zwischen 0,04 und 0,12 (d. H. Der Region mit reduzierter Steigung) basieren, unterschätzen das wahre Niveau der Enzymaktivität, da etwas die Größe des Assaysignals eindeutig begrenzt.
Viele Faktoren können den linearen Bereich begrenzen, und der Bereich variiert von Assay zu Assay. Ein häufiger Grund für die Nichtlinearität ist ein übermäßiger Substratverbrauch, der zu einem Abfall der Reaktionsgeschwindigkeit führen kann, aber auch Einschränkungen der optischen Komponenten des Plattenlesegeräts (oder des verwendeten Messgeräts) können erheblich sein. Die meisten Plattenleser können beispielsweise Extinktionswerte über 3 nicht zuverlässig messen, und diese Einschränkung gilt unabhängig vom Prozentsatz des Substrats, das in Produkt umgewandelt wurde.
Abb. 1. Absorption versus Enzymmenge
Obwohl in diesem Handbuch nicht anders beschrieben, sollte man sich auch bewusst sein, dass Enzyme im Laufe der Zeit denaturieren können, insbesondere wenn sie sehr verdünnt sind, und die Produkte einiger Reaktionen das Enzym hemmen können. In der Tat gibt es andere mögliche Gründe für das nichtlineare Verhalten, aber es ist normalerweise relativ einfach, den linearen Bereich durch Versuch und Irrtum unter Verwendung serieller Verdünnungen des Enzyms wie oben beschrieben zu finden.
Assayzeit und -temperatur
Diese Parameter können auch den linearen Bereich beeinflussen, da sie die Geschwindigkeit der Substratumwandlung beeinflussen. Beispielsweise kann ein Assay nach 15 min linear sein, aber nach 60 Minuten kann zu viel Substrat verbraucht worden sein. In dieser Situation müssten Sie die Enzymmenge reduzieren, um Ihren Assay 60 Minuten lang ausführen zu können. Die gleichen Überlegungen gelten für die Assay-Temperatur, da sie auch die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen kann.
Die meisten Menschen nehmen eine Testzeit von irgendwo zwischen 15 min und 60 min an. Sehr kurze Zeiten (z. B. 2 min) sind zu vermeiden, da eine leichte Verzögerung beim Stoppen der Reaktion zu einem signifikanten Fehler bei der Berechnung der Aktivität führt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die in einem Kühl- oder Gefrierschrank gelagerten Reagenzien vor der Verwendung auf die richtige Temperatur gebracht wurden, und dies ist besonders wichtig, wenn Sie eine relativ kurze Testzeit haben.
Assayvolumen/Empfindlichkeit
Aus praktischer Sicht wird das Assayvolumen durch das Verbrauchsmaterial bestimmt/begrenzt, das Sie für Ihre Assays verwenden (z. B. Küvetten, Röhrchen oder Mikroplatten). Das Signal für die meisten Enzymassays ist proportional zum Assayvolumen und Versuche, den Assay zu miniaturisieren (z. B. um Reagenzien zu konservieren), führen normalerweise zu niedrigeren Signalen. Extinktionstests sind jedoch häufig eine Ausnahme, und ein Wechsel von einer 3-ml-Küvette zu einer 1-ml-Mikroküvette ändert beispielsweise den Extinktionswert nicht, wenn die Breite (Weglänge) der Küvette noch 1 cm beträgt (d. h. das Licht durchläuft immer noch die gleiche ‚Länge‘ der Flüssigkeit). Dies liegt daran, dass die Absorption proportional zur Weglänge und nicht zum Probenvolumen ist.
In Mikroplatten-Absorptionsassays ist die Weglänge gleich der Tiefe der Flüssigkeit, und es ist möglich, ohne Signalverlust zu miniaturisieren, indem der Durchmesser der Vertiefungen verringert und eine konstante Flüssigkeitstiefe beibehalten wird. Zum Beispiel können 96-Well-Platten leicht 200ul Probe aufnehmen, aber mit einem 50ul-Assay-Volumen wäre es besser, eine 384-Well-Platte zu verwenden, um die Weglänge gegenüber 50ul Probe in einer 96-Well-Platte zu erhöhen.
Kontinuierliche Assays (Messung des Produktaussehens über die Zeit)
Die meisten Assays werden für einen festgelegten Zeitraum durchgeführt (Endpunkt-Assays) und die Reaktion wird durch Zugabe eines Stoppreagenzes (z. B. Säure) gestoppt. In kontinuierlichen Assays wird jedoch das Aussehen des Produkts (seltener der Verbrauch des Substrats) kontinuierlich aufgezeichnet (z. mittels eines Kartenrekorders). Es gelten die gleichen Grundregeln; Ein Diagramm von Signal über Zeit für eine feste Enzymmenge sollte linear sein und die Rate sollte sich verdoppeln, wenn die Enzymmenge verdoppelt wird. Solange der Assay im linearen Bereich betrieben wird, kann die Aktivität entsprechend verdünnter Unbekannter aus den anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten, die mit einer Reihe von Standards gemessen wurden, genau bestimmt werden.
Welche Substratkonzentration sollte ich verwenden?
Die Konzentration des Substrats beeinflusst die Reaktionsgeschwindigkeit, aber es gibt mehrere Faktoren, die bei der Auswahl der ‚richtigen‘ Konzentration zu berücksichtigen sind. Aus praktischer Sicht ist eine Schlüsselüberlegung die Menge an Produkt, die erzeugt werden muss, um ein messbares Assay-Signal zu liefern. Da die Geschwindigkeit einer Enzymreaktion wahrscheinlich sinkt, wenn mehr als etwa 15% des Substrats hydrolysiert wurden, sollte die Anfangskonzentration des Substrats im Allgemeinen mindestens das 10-fache der Produktkonzentration betragen, von der bekannt ist, dass sie ein akzeptables Assaysignal liefert.
Eine weitere Überlegung sind die Anforderungen an das Substrat. Während das Hinzufügen von mehr Substrat im Allgemeinen bedeutet, dass Sie höhere Aktivitätswerte sehen, ist die Beziehung nicht linear und die Kosten des Substrats müssen möglicherweise berücksichtigt werden. An dieser Stelle ist es wahrscheinlich sinnvoll, die klassische Michaelis-Menten-Gleichung einzuführen:
v = (Vmax S)/(Km + S) ……………. Eqn. (1)
wobei v die Rate ist, Vmax die maximal mögliche Rate ist, S die Substratkonzentration ist und Km gleich der Substratkonzentration ist, die die maximale Aktivität ergibt. Die Ableitung dieser Gleichung und ihrer zugrunde liegenden Annahmen kann in jedem Lehrbuch zur Enzymkinetik gefunden werden. Obwohl es normal ist, die Geschwindigkeit von Enzymreaktionen eher zu messen als zu berechnen, ist es nützlich, die zugrunde liegenden Prinzipien für den Zweck des Assay-Designs zu verstehen.
Die Michaelis-Menten-Gleichung ist insofern nützlich, als sie Ihnen hilft, eine geeignete Substratkonzentration auszuwählen, wenn die Km bekannt ist.
Wenn S=Km, v = (Vmax S)/2S, d.h. v/Vmax = S/2S = ½.
Mit anderen Worten, das Enzym arbeitet mit 50% seiner maximal möglichen Rate, wenn S=Km .
Wenn Sie in Gleichung 1 die Werte für S = 10 und Km = 1 einsetzen, werden Sie sehen, dass das Enzym durch Erhöhen der Substratkonzentration um das 10-fache jetzt mit ~ 90% seiner maximal möglichen Rate anstelle von 50% arbeitet. Klar ist das höher, aber nicht 10 mal höher.
Bei sehr hohen Substratkonzentrationen wird der Km in Gleichung 1 numerisch unbedeutend und die gemessene Rate ist dann gleich Vmax.
Viele Assays werden mit einer Substratkonzentration bei oder um den Km-Wert durchgeführt, aber wenn der Km sehr hoch ist, ist es möglicherweise nicht möglich, eine so hohe Substratkonzentration zu verwenden (z. b. aus Kostengründen oder begrenzter Löslichkeit).
In manchen Situationen kann es sogar ratsam sein, eine relativ niedrige Substratkonzentration zu verwenden. Zum Beispiel in der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, die Verwendung von sehr hohen Substratkonzentrationen würde es schwieriger machen, kompetitive Enzyminhibitoren zu identifizieren (kompetitive Inhibitoren binden an die gleiche Stelle wie das Substrat).
Es muss ein Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Faktoren hergestellt werden, damit der Assay ein messbares Signal hat, im linearen Bereich betrieben werden kann und alle anderen Assay-Ziele (z. B. Kosten, Zeit usw.) erfüllt werden können.
Standardkurven
Eine Standardkurve ist immer erforderlich, wenn Sie die Enzymaktivität berechnen möchten. Es ist nicht unbedingt erforderlich, wenn Sie nur an relativen Aktivitätswerten interessiert sind.
Die Standardkurve wird konstruiert, indem das Assaysignal mit Standardlösungen des Reaktionsprodukts über einen geeigneten Konzentrationsbereich gemessen wird. Idealerweise sollten Sie für jedes Experiment eine Standardkurve ausführen, aber wenn die Standardkurve sehr reproduzierbar ist, kann es akzeptabel sein, sie regelmäßig auszuführen.
Eine typische Standardkurve ist in Abbildung 2 dargestellt. Dies ist eine Standardkurve für einen ATPase-Assay, bei dem ATP zu ADP und Pi (anorganisches Phosphat) hydrolysiert wird.
Abb. 2. Standardkurve für Pi
Der Nachweis des Phosphats erfolgt mittels eines Farbstoffbindungsreagenzes, das in Gegenwart von Phosphat seine Farbe ändert. Unabhängig von der Art des Produkts oder der verwendeten Nachweismethode muss eine Standardkurve erstellt werden, die die Abhängigkeit des Signals von der Produktmenge im Assay zeigt. Die ‚Kurve‘ (idealerweise ist es eine gerade Linie) wird verwendet, um die Menge an Produkt zu bestimmen, die in Proben mit unbekannter Aktivität erzeugt wird, d. H. aus dem Extinktionswert, indem der Schnittpunkt auf der x-Achse abgelesen wird. (Die meisten grafischen Softwarepakete berechnen automatisch Werte von x aus gemessenen Werten von y). Die Höhe der Aktivität kann dann berechnet werden (siehe später).
Zeichne ich Konzentration oder absolute Menge auf der X-Achse?
Hier gibt es keine einzige richtige Antwort, und die Möglichkeit, einen der beiden Ansätze zu verwenden, kann häufig zu Verwirrung führen, wenn Aktivitätswerte berechnet werden. Das Zeichnen von nmol des Produkts auf der x-Achse ist beispielsweise sehr praktisch, wenn Sie Aktivitätswerte berechnen müssen (denken Sie daran, Aktivität = nmol pro Minute pro ml). Laborreagenzien werden jedoch normalerweise in bekannten Konzentrationen hergestellt, und es ist oft einfacher, diese Werte auf der x-Achse darzustellen. Wenn Sie jedoch die Aktivität (oder spezifische Aktivität) Ihres Enzyms berechnen, müssen Sie daran denken, die Konzentration auf der x-Achse in die Anzahl der gebildeten nmole des Produkts umzurechnen, was bedeutet, dass Sie das Assayvolumen berücksichtigen müssen. Der Grund ist leicht zu verstehen: 50ul und 100ul Volumen einer Standardlösung werden in der gleichen Konzentration sein, aber das größere Volumen wird die doppelte Menge an Produkt enthalten. Im Allgemeinen ist es am besten, einen Ansatz zu wählen (d. H. Entweder die absolute Menge des Produkts oder die Konzentration), so dass immer die gleiche Methode zur Berechnung der Aktivität verwendet wird.
Kontrollen und Subtraktion von ‚leeren‘ Daten
Richtige Kontrollen sind für die quantitative Arbeit von entscheidender Bedeutung, ebenso wie die korrekte Verwendung der Kontrolldaten in Berechnungen.
Kontrollen sagen Ihnen (indirekt), wie viel des Assaysignals auf die Wirkung des Enzyms zurückzuführen ist und wie viel aus anderen Gründen entsteht. Eine häufige Quelle für ‚falsches‘ Signal ist das Substrat (das oft mit Produkt kontaminiert sein kann). Andere Assay-Komponenten können je nach Art der Komponenten und Art des Assays auch ein kleines Signal erzeugen. Der Zweck der Kontrollen besteht darin, Ihnen zu erlauben, (durch Subtraktion) alle Elemente des Gesamtsignals zu entfernen, die nicht mit der Wirkung des Enzyms zusammenhängen. Wenn der Assay gut gestaltet ist und die Assay-Reagenzien von guter Qualität sind, ist die Behandlung von Kontrollen normalerweise recht einfach.
Nachfolgend finden Sie einige allgemeine Richtlinien:
Wenn wir zum kolorimetrischen Assay zum Nachweis von anorganischem Phosphat zurückkehren, können wir einige potenzielle Probleme hervorheben, die bei ordnungsgemäßen Kontrollen leicht erkannt werden können.
Das Phosphatnachweisreagenz liefert einen niedrigen Messwert von etwa 0,08 in einer 96-Well-Platte bei der für die Messung verwendeten Wellenlänge (etwa 650 nm).
Wir könnten die folgenden Assays / Kontrollen einrichten (Werte in Klammern in einer hypothetischen Assay-Situation):
- Alle Assay-Komponenten minus Enzym (0.5)
- Enzym allein (0.1)
- Enzym plus alle anderen Komponenten (1.8)
Offensichtlich ist das Assay-Signal von 1.8 nicht allein auf die Wirkung des Enzyms auf das Substrat zurückzuführen.
Für jeden Enzymtest besteht eine Schlüsselkontrolle (A) darin, das Enzym wegzulassen (und durch Puffer zu ersetzen). Dadurch erhalten Sie das Hintergrundsignal für alle anderen Assaykomponenten als Gruppe, einschließlich des Substrats, das eine kleine Menge Produkt enthalten kann. Diese Kontrolle sagt Ihnen nicht das Hintergrundsignal für das Enzym, aber Sie können das Enzym eindeutig nicht als Kontrolle zum Substrat hinzufügen! In den meisten Assays gibt das Enzym kein Signal, da es vor der Verwendung im Assay signifikant verdünnt wird. Dies kann leicht überprüft werden, wie in B oben.
Die Daten für Probe A (oben) deuten darauf hin, dass das Gemisch mit anorganischem Phosphat kontaminiert ist. Die einzelnen Komponenten können dann überprüft werden, um die Ursache des Problems zu identifizieren. Diese Situation ist ziemlich häufig für Assays von ATPasen und anderen Phosphat erzeugenden Enzymen, da die Substrate oft instabil sind und teilweise hydrolysiert werden, um etwas anorganisches Phosphat zu ergeben.
Es kann umständlich sein, Rohdaten zu korrigieren, wenn mehrere Komponenten falsche Signale geben; Die Beseitigung des Problems an der Quelle ist im Allgemeinen weitaus besser als jede mathematische Behandlung. Der ‚korrigierte‘ Wert für die obige Stichprobe C scheint 1,2 zu sein (d.h. 1.8 – 0.5 – 0.1 ) aber streng genommen ist das falsch. Denken Sie daran, dass die Testplatte und das Nachweisreagenz ein Hintergrundsignal von etwa 0,08 ergeben, so dass die Quelle des größten Teils des Signals für Kontrolle A der Kunststoff der Platte und / oder des Nachweisreagenzes ist. Das gleiche kleine Signal muss auch innerhalb des Wertes für die Enzymkontrolle verborgen sein. Daher haben wir in der oben angewendeten Korrektur diesen verborgenen Rohling zweimal subtrahiert.
Sie müssen immer Kontrollen von Assay-Daten subtrahieren, und es ist vorzuziehen, alle Substanzen (außer Enzym) zu kombinieren und einen einzelnen Wert zu subtrahieren. Wird dieser Ansatz gewählt, wird die Standardkurve in gleicher Weise behandelt und ein Kontrollwert subtrahiert (d.h. der Wert, der in Abwesenheit von Produkt erhalten wird, d.h. analog zu dem oben diskutierten Platten- /Reagenzienrohling). Somit enthalten weder die subtrahierten Assaydaten noch die subtrahierte Standardkurve das potenziell irreführende Hintergrundsignal, das durch das Platten-/Assayreagenz verursacht wird.Schließlich, wie wir gesehen haben, werden falsche Signale mit richtigen Kontrollen leicht erkannt, aber die beste Strategie, um Daten von guter Qualität zu erhalten, ist die Verwendung von Reagenzien mit niedrigem Hintergrund, so dass die Kontrollwerte niedrig sind. Es ist auch nützlich, ein Assay-Signal (aufgrund des Enzyms) zu erzeugen, das weit höher ist als jedes Hintergrundsignal. Idealerweise sollte das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis mindestens 5 und vorzugsweise 10 oder mehr für eine genaue quantitative Arbeit betragen.
Aktivitätswerte berechnen
Dies ist ziemlich einfach zu verstehen, wenn wir schrittweise aus rohen Assay-Daten zurückrechnen. Nehmen wir zum Beispiel an, wir haben 10nmol Produkt in unserer Enzymreaktion erzeugt (dh bestimmt aus der Standardkurve des Signals gegen die absolute Produktmenge). Da die Aktivität als nmol pro Minute pro ml ausgedrückt wird, müssen wir Zeit und Volumen und, vielleicht weniger offensichtlich, die Menge und Verdünnung des Enzyms berücksichtigen, um die Aktivität zu berechnen.
Wenn der Test 10 Minuten lang ist, beträgt die Anzahl der nmol pro Minute im obigen Beispiel 1. (schritt 1)
Wenn das Assayvolumen 200ul beträgt, müssen wir mit 5 multiplizieren (d. H. 1000/200), um nmol pro Minute pro ml zu erhalten. (schritt 2)
Dieser Wert bezieht sich auf die Aktivität des Enzyms im Assay, nicht auf die Enzymprobe, die zum Aufbau des Assays verwendet wurde. Einige weitere Korrekturfaktoren sind erforderlich, um die Enzymaktivität in der ursprünglichen Enzymprobe zu bestimmen.
Das Enzym kann vor der Verwendung verdünnt worden sein und muss durch die anderen im Assay vorhandenen Komponenten weiter verdünnt werden. Wenn der Test (insgesamt 200ul) 20ul Enzym enthält und das Enzym 1/100 vorverdünnt wird, bevor die 20ul-Probe hinzugefügt wird, können Sie wahrscheinlich sehen, dass wir zuerst mit 10 (Schritt 3) und dann mit 100 (Schritt 4) multiplizieren sollten, um die Aktivität des Enzyms in der ursprünglichen Enzymlösung zu erhalten.
Bisher ist dies relativ einfach. Wir haben jedoch bereits erwähnt, dass die Konzentration häufig auf der x-Achse der Standardkurve aufgetragen ist. Daher können die Werte in mM ausgedrückt werden (nicht in mmol), und Sie können die Anzahl der mmol nicht einfach durch Untersuchen der Standardkurve bestimmen.
Da mM mmol pro Liter bedeutet, haben wir eine Diskrepanz zwischen dem implizierten Volumen von 1L und dem tatsächlichen Assayvolumen. Wenn wir also ein 10-mm-Produkt haben und das Assay-Volumen 200ul beträgt, müssen wir durch 5000 dividieren, um die Anzahl der mmol des Produkts zu erhalten.
Sie können hier feststellen, dass die Division durch 5000 hier einige der oben erforderlichen Multiplikationsoperationen ausgleicht. In der Tat ist es ganz normal, dass sich Korrekturfaktoren aufheben. In einem 10-minütigen Assay mit 1/10 verdünntem Enzym dividieren Sie beispielsweise durch 10, um nmol pro Minute zu erhalten, und multiplizieren Sie später mit 10, um den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
Daraus folgt, dass, wenn Sie immer Standard-Assay-Bedingungen verwenden (d.h. Standardkurve mit einem einzigen globalen Korrekturfaktor multiplizieren, der alle anderen individuellen Korrekturfaktoren umfasst, um Ihre Aktivitätswerte zu berechnen. Nur bei der ersten Gelegenheit müssen Sie die einzelnen Korrekturfaktoren identifizieren.
Enzymhemmung / Wirkstoffscreening
Dies ist ein Bereich der Enzymologie, in dem weiterhin im linearen Bereich gearbeitet werden muss, in dem Berechnungen von Aktivitätswerten jedoch normalerweise nicht relevant sind; vielmehr ist die relative Reaktionsgeschwindigkeit (oder die relative Menge des gebildeten Produkts) in Gegenwart und Abwesenheit einer Testsubstanz von entscheidender Bedeutung, was wenig mehr als einfache Berechnungen unter Verwendung der blindsubtrahierten Assay-Daten erfordert. Nach Subtraktion der Rohlinge wird die gebildete Produktmenge als Prozentsatz der in Abwesenheit der Testsubstanz erhaltenen Menge (d. h. 100%) ausgedrückt. Diese Tests können manchmal mit recht niedrigen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen durchgeführt werden, da die Frage gestellt wird – hemmt die Testsubstanz die Reaktion?
– erfordert nur eine Ja / Nein-Antwort.
Zusammenfassung
Dieser Leitfaden enthält hoffentlich klare Erklärungen zu ‚Enzymeinheiten‘, ‚Enzymaktivität‘ und ’spezifischer Enzymaktivität‘ sowie Einheitendefinitionen und die Bedeutung des ‚linearen Bereichs‘. Die Einzelheiten dessen, was auf der x-Achse von Standardkurven gezeichnet werden soll, sind eine Frage der Benutzerpräferenz, aber bei der Berechnung der Aktivitäten ist Vorsicht geboten. Assay-Kontrollen sind wichtig, aber die Verwendung hochwertiger Reagenzien ist besser als das Entfernen von Hintergründen mit mathematischen Ansätzen. Ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis ist für quantitative Arbeiten wünschenswert, und eine Reihe von Parametern kann variiert werden, um das Assay-Signal zu erhöhen; es ist nicht immer notwendig, einfach mehr Enzym hinzuzufügen. Enzymaktivitätswerte können leicht berechnet werden, wenn ein schrittweiser Ansatz verwendet wird, um die wichtigsten Assayvariablen zu identifizieren.
Weitere Protokolle und Anleitungen