Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Die Massenspektrometrie ist eine äußerst vielseitige instrumentelle Technik, deren Wurzeln in der Anwendung traditionellerer Flüssigkeitschromatographie auf Theorien und Instrumente liegen, die ursprünglich für die Gaschromatographie (GC) entwickelt wurden. Wie der Name schon sagt, besteht die Instrumentierung aus einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC), der über eine geeignete Schnittstelle an ein Massenspektrometer (MS) angeschlossen ist. Der Hauptvorteil der HPLC / MS gegenüber GC / MS besteht darin, dass sie in der Lage ist, ein viel breiteres Spektrum von Komponenten zu analysieren. Verbindungen, die thermisch labil sind, eine hohe Polarität aufweisen oder eine hohe Molekülmasse aufweisen, können alle mittels HPLC/MS analysiert werden, sogar Proteine können routinemäßig analysiert werden. Lösungen, die aus Proben von Interesse gewonnen werden, werden auf eine HPLC-Säule injiziert, die ein schmales Edelstahlrohr (normalerweise 150 mm Länge und 2 mm Innendurchmesser oder kleiner) enthält, das mit feinen, chemisch modifizierten Kieselsäurepartikeln gefüllt ist. Die Trennung der Verbindungen erfolgt aufgrund ihrer relativen Wechselwirkung mit der chemischen Beschichtung dieser Partikel (stationäre Phase) und dem durch die Säule eluierenden Lösungsmittel (mobile Phase). Aus der Chromatographiesäule eluierende Komponenten werden dann über eine spezielle Schnittstelle in das Massenspektrometer eingebracht. Die beiden am häufigsten verwendeten Schnittstellen für HPLC / MS sind die Elektrospray-Ionisation und die Atmosphärendruck-chemische Ionisation Schnittstellen.
Elektrospray-Ionisation
Bei der Elektrospray-Ionisation wird der Analyt mit Flussraten typischerweise in der Größenordnung von 1µl min-1 in die Quelle eingeführt. Der Fluss der Analytlösung durchläuft die Elektrospraynadel, an der eine hohe Potentialdifferenz (in Bezug auf die Gegenelektrode) angelegt ist (typischerweise im Bereich von 2,5 bis 4 kV). Dies zwingt das Sprühen geladener Tröpfchen von der Nadel mit einer Oberflächenladung gleicher Polarität zur Ladung auf der Nadel. Die Tröpfchen werden von der Nadel in Richtung des Quellentnahmekegels auf der Gegenelektrode abgestoßen (blau dargestellt). Während die Tröpfchen den Raum zwischen der Nadelspitze und dem Kegel durchqueren, tritt Lösungsmittelverdampfung auf. Dies ist in der Fig.1 und in Fig.2. Wenn die Lösungsmittelverdampfung auftritt, schrumpft das Tröpfchen, bis es den Punkt erreicht, an dem die Oberflächenspannung die Ladung nicht mehr aufrechterhalten kann (die Rayleigh-Grenze), an dem eine „Coulomb-Explosion“ auftritt und das Tröpfchen auseinandergerissen wird. Dies erzeugt kleinere Tröpfchen, die den Prozess sowie die geladenen Analytmoleküle wiederholen können. Diese geladenen Analytmoleküle (sie sind nicht ausschließlich Ionen) können einfach oder mehrfach geladen sein. Dies ist eine sehr weiche Ionisationsmethode, da der Analyt bei der Ionisation nur sehr wenig Restenergie zurückhält. Es ist die Erzeugung von mehrfach geladenen Molekülen, die es ermöglicht, hochmolekulare Komponenten wie Proteine zu analysieren, da der Massenbereich des Massenspektrometers stark vergrößert ist, da es tatsächlich das Verhältnis von Masse zu Ladung und nicht die Masse an sich misst. Der Hauptnachteil der Technik besteht darin, dass sehr wenig (normalerweise keine) Fragmentierung erzeugt wird, obwohl dies durch die Verwendung von Tandem-massenspektrometrischen Techniken wie MS / MS oder MSn überwunden werden kann.
Abbildung 1 Eine schematische Darstellung einer ESI-Schnittstelle
Abbildung 2 Eine schematische Darstellung des Mechanismus der Ionenbildung
Atmosphärendruck chemische Ionisation
Atmosphärendruck chemische Ionisation (APCI) analoge Ionisationsmethode zur chemischen Ionisation (CI). Der wesentliche Unterschied besteht darin, dass APCI bei Atmosphärendruck auftritt und seine Hauptanwendungen in den Bereichen der Ionisation von Verbindungen mit geringer Masse hat (APCI ist nicht für die Analyse thermisch labiler Verbindungen geeignet). Der allgemeine Quellenaufbau (siehe Abb. 3) hat eine starke Ähnlichkeit mit ESI. Wo sich APCI von ESI unterscheidet, liegt in der Art und Weise, wie Ionisation stattfindet. Bei der ESI erfolgt die Ionisation über die Potentialdifferenz zwischen Sprühnadel und Kegel sowie eine schnelle, aber schonende Desolvation. In APCI wird die Analytlösung in einen pneumatischen Vernebler eingeführt und in einem beheizten Quarzrohr desolviert, bevor sie mit der Koronaentladung wechselwirkt und Ionen erzeugt. Die Koronaentladung ersetzt das Elektronenfilament in CI – der atmosphärische Druck würde alle Filamente schnell „ausbrennen“ – und erzeugt durch Elektronenionisation primäres N2 °+ und N4 °+. Diese primären Ionen kollidieren mit den verdampften Lösungsmittelmolekülen, um sekundäre Reaktanden-Gasionen zu bilden – z. B. H3O + und (H2O) nH + (siehe Abb. 4). Diese Reaktanden-Gasionen unterliegen dann wiederholten Kollisionen mit dem Analyten, was zur Bildung von Analyt-Ionen führt. Die hohe Kollisionsfrequenz führt zu einer hohen Ionisationseffizienz und Thermalisierung der Analytenionen. Dies führt zu Spektren von überwiegend molekularen Spezies und Adduktionen mit sehr geringer Fragmentierung. Sobald die Ionen gebildet sind, treten sie ähnlich wie ESI in die Pump- und Fokussierstufe ein.
Abbildung 3 Ein Schema der Komponenten einer APCI-Quelle
Abbildung 4 Eine detailliertere Ansicht des Mechanismus von APCI
Diagramme und Text (teilweise) von Dr. Paul Gates, School of Chemistry, University of Bristol