Während des Translokationsschritts der Elongationsphase der Proteinsynthese wird die mRNA in einem durch den Elongationsfaktor EF-G (1) katalysierten Prozess um ein Codon vorgeschoben, gekoppelt an die Bewegung der tRNAs von den ribosomalen A (Aminoacyl) zu P (Peptidyl) und P zu E (exit). Zuerst bewegen sich die tRNAs auf der 50S-Untereinheit in P / E- und A / P-Hybridzustände, gefolgt von einer Bewegung der tRNA-Anticodon-Stammschleifen (ASLs) von den 30S-Untereinheiten A und P zu den P- bzw. Der erste Schritt wird von einer Rotation zwischen den Untereinheiten begleitet (3-7), während der zweite Schritt EF-G · GTP erfordert und die Rotation der 30S-Untereinheitskopfdomäne beinhaltet (8-11). Obwohl in letzter Zeit viel über die strukturelle Basis der P-tRNA-Bewegung zum E-Standort gelernt wurde (9, 10, 12, 13), Translokationszwischenprodukte, die A-tRNA enthalten, sind schwieriger zu fangen. Daher basiert ein Großteil unseres Denkens über die strukturelle Basis der A-tRNA- und mRNA-Bewegung auf Kristallstrukturen von EF-G, die an freie (14) oder P-tRNA-haltige Ribosomenkomplexe gebunden sind, die in klassischen (15) oder hybriden Zuständen (10, 12, 13) gefangen sind, und zwei Kryo-EM-Strukturen von 70S-Ribosomen-EF-G-Komplexen, die zwei tRNAs enthalten, die in P / E- und A / P * -Hybridzuständen (16) oder in ap / P- und pe / E-chimären Hybridzuständen (11) gebunden sind.
Hier berichten wir über die Kristallstruktur eines 70S-Ribosomen-Translokations-Intermediats, das EF-G, mRNA und zwei tRNAs enthält – eine deacylierte tRNA, die im pe / E-Zustand gebunden ist, und eine Peptidyl-tRNA, die in einem ap / Ap-chimären Hybridzustand gefangen ist. Der Komplex wurde mit T. thermophilus 70S-Ribosomen, einer 39-Nukleotid-mRNA, Elongator tRNAMet in der P-Stelle und N-Acetyl-Val-tRNAVal in der A-Stelle gebildet. Um das Translokationszwischenprodukt einzufangen, fügten wir Neomycin hinzu, um den Abschluss der Translokation zu blockieren, und Fusidinsäure, um die Freisetzung von EF-G zu verhindern (ergänzende Methoden; Abb. S1). Die Struktur wurde unter Verwendung von Beugungsdaten zu 3,8 Å aus einem Einkristall gelöst (Tabelle S1). Beispiele für die Elektronendichte sind in Supplementary materials (Fig. S2-S13). Relativ zum Ribosom im klassischen Zustand (17) erfährt der Kopf der 30S-Untereinheit eine große Drehung um 21 ° gegen den Uhrzeigersinn und der 30S-Körper eine Drehung um 2,7 ° relativ zur 50S-Untereinheit (Abb. 1, Fig.2A, B). Die P-tRNA-Anticodon-Stammschleife (ASL) bewegt sich mit dem 30S-Kopf in eine Position zwischen der P-Stelle des 30S-Kopfes und der E-Stelle des 30S-Körpers (PE-chimärer Zustand; 1D, E), während sich sein Akzeptorende vollständig in die 50S E-Stelle bewegt (Figur 1C) und einen pe / E-chimären Hybridzustand bildet (9-11). Die A-tRNA ASL bewegt sich innerhalb von ~ 4Å der P-Site-Elemente des 30S-Körpers (Abb. 1D); sein Ellbogen dreht sich in Richtung der klassischen 50S-P-Stelle, aber sein Akzeptorende ist zwischen den 50S-Untereinheit A- und P-Stellen gebunden (Abb. 1C), die einen ap/ap-chimären Hybridzustand bilden. Die große, EF-G-abhängige Rotation des 30S-Kopfes in unserer Struktur positioniert die Helix H38 der 23S-rRNA neu, so dass der A-tRNA-Ellbogen die Position des P-Site-tRNA-Ellbogens erreichen kann (Abb. S14). Die Domäne IV von EF-G ist in die Konvergenzstelle des A-Site-mRNA-Codons, der Anticodonschleife der ap / Ap-tRNA und der 16S- und 23S-rRNAs an der Intersubunitbrücke B2a eingekeilt und kontaktiert gleichzeitig alle vier RNAs (Abb. S15).
(A) 70S-Ribosom mit tRNAs, die in klassischen A / A- und P / P-Zuständen gebunden sind (17); (B) Translokations-Intermediärkomplex, der tRNAs zeigt, die in intermediären chimären Hybrid-Ap / Ap- und pe / E-Zuständen gefangen sind. (C) Vergleich der Positionen von tRNA in klassischen Zuständen und im Translokationszwischenprodukt, ausgerichtet auf die 50S-Untereinheit; (D) relative Positionen von tRNA-ASLs, ausgerichtet auf den Körper der 30S-Untereinheit oder (E) Kopf. Molekulare Komponenten sind durchgehend gefärbt als: 16S rRNA, Cyan; 30S Proteine, blau; 23S rRNA, grau; 5S rRNA, hellblau; 50S Proteine, magenta; mRNA, grün; A / A und ap/ap tRNAs, gelb; P / P und pe /E tRNAs, rot; EF-G, orange.
(A-B) Positionen von tRNAs im (A) Ribosom im klassischen Zustand und (B) Translokationszwischenprodukt. (C–D) Wechselwirkungen der tRNA ASLs und mRNA beim Übergang von den klassischen Zuständen (C) A und P zu den chimären Hybridzuständen (D) ap und pe. (E–F) Umlagerung der 966-Schleife (h31) von 16S-rRNA im 30S-Untereinheitskopf von seiner (E) klassischen P-tRNA-Bindungsposition zu (F) bildet eine Oberflächenanpassung Tasche um die ap / ap tRNA ASL.
Obwohl die 30S-Kopfrotation die ASL-Translokation an der P-Stelle deutlich erleichtert (9-11), wird die ASL an der A-Stelle durch einen anderen Mechanismus transloziert. Die P-Site-ASL bewegt sich genau mit 30S-Kopfdrehung in den pe / E-Zustand, während sich die A-Site-ASL weiter bewegt hat als die Drehbewegung des Kopfes in den ap-Zustand an der 30S-Untereinheit (Fig. 1E). Die Bewegung der A-Site-ASL genau mit der Kopfrotation würde zu einem schweren Zusammenstoß mit der Domäne IV von EF-G führen, da sie in unserem Komplex positioniert ist, was zusammen mit dem Kontakt zwischen der Spitze der Domäne IV und der Codon-Anticodon-Helix der ap / Ap-tRNA (Abb. S16) darauf hindeutet, dass die Bewegung von mRNA und ASL mit der von Domäne IV gekoppelt ist. Die zusätzliche Verschiebung der ap / Ap-ASL bringt sie nahe an die pe / E-ASL (Abb. 2C, D) (11). Die Position des Kopfes kann durch Wechselwirkung zwischen Phosphat 1210 von 16S rRNA mit Domäne IV von EF-G bei Gly531 stabilisiert werden.Am auffälligsten ist die Umlagerung der 16S rRNA 966-Schleife im 30S-Kopf, die sich von der P-Stelle löst, um zur A-Stelle zu gelangen, wo sie den Kontakt mit der teilweise translozierten ap / ap-ASL initiiert (Abb. 2E, F). Diese Umlagerung beinhaltet die Unterbrechung der Packung von m22G966 gegen Ribose 34 der P-Site ASL (18, 19) und die Bildung einer Oberflächenanpassung Tasche um die ap / ap-ASL durch Nukleotide A965, m22G966 und C1400. In einer Kristallstruktur des entsprechenden Einzel-tRNA-Komplexes (10) (Fig. S6) wurde festgestellt, dass die pe / E-tRNA-ASL alle kanonischen P-Site-Kontakte mit dem 30S-Kopf, einschließlich der 966-Schleife, aufrechterhält, wenn sie sich in Richtung der E-Site dreht. In dem hier berichteten Zwei-tRNA-Komplex wird jedoch nur eine Untergruppe der P-Site 30S-Kopfinteraktionen mit der pe / E-ASL aufrechterhalten, an denen G1338, A1339, A1340 und der C-terminale Schwanz des Proteins uS9 beteiligt sind. Die Bildung von Post-Translokations-Interaktionen gleichzeitig mit der Störung von Pre-Translokations-Interaktionen, schlägt einen Mechanismus vor, wie die ASLs zwischen den A- und P-Sites übergeben werden. Es kann auch eine anfängliche Verschiebung der Kontakte darstellen, die unterbrochen werden muss, um die Pe / E-tRNA-ASL vor der Rückrotation des 30S-Kopfes in den Endstadien der Translokation freizusetzen (20, 21).
Das Netzwerk von Wechselwirkungen zwischen der konservierten Schleife 1 (Reste 499-504) in Domäne IV von EF-G, der ap/ ap ASL und ihrem mRNA-Codon (Abb. S15) (11) ähneln denen, die im Post-Translokationszustand (15) beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass sie während des gesamten Translokationszyklus beibehalten werden. Ihre Ähnlichkeit mit den Minor-Groove-Wechselwirkungen von A1492 und A1493 mit der Codon-Anticodon-Helix in der Decodierstelle (22) legt nahe, dass sie dazu beitragen können, die korrekte Codon-Anticodon-Paarung während der Bewegung zwischen den A- und P-Stellen (15) aufrechtzuerhalten, und stehen im Einklang mit dem Vorschlag, dass EF-G die Translokation durch destabilisierende Wechselwirkungen in der 30S-Decodierstelle erleichtert (23).
Es wurden Wechselwirkungen zwischen der mRNA und Elementen des 30S-Kopfes innerhalb des stromabwärts gelegenen mRNA-Eintrittstunnels vorgeschlagen, um die mRNA während der Kopfrotation mit der tRNA vorwärts zu tragen (17). Es ist jedoch nicht klar, dass die Nettobewegung der mRNA auf diese Weise aufrechterhalten werden könnte, da diese Wechselwirkungen während der Kopfrotation gestört sind. Wir finden, dass sich der verlängerte Schwanz der mRNA, wenn er aus dem stromabwärts gelegenen Tunnel austritt, nach oben krümmt, um an die Oberfläche des Proteins uS3 im Kopf der Untereinheit zu binden (Abb. 3, S17). Somit würde die Vorwärts-Kopfrotation die mRNA aktiv in Richtung der Translokation bewegen. Ein Vergleich der Position eines Referenznukleotids auf der mRNA im gedrehten und nicht gedrehten Zustand zeigt weiter, dass eine Vorwärtsdrehung des Kopfes die mRNA um ein Codon vorschieben würde (Fig. 3D), was die Möglichkeit unterstützt, dass die mRNA während der Translokation aktiv vom Ribosom bewegt wird. Da die Abmessungen des stromabwärts gelegenen Tunnels den Eintritt einer RNA-Helix ausschließen, muss die Störung der mRNA-Sekundärstruktur durch die ribosomale Helikase (24) am oder in der Nähe des Eintritts in den Tunnel durch Wechselwirkung mit dem Ribosom außerhalb des Tunnels erfolgen. Die Bindung des mRNA-Schwanzes, der den Eingang des Tunnels unmittelbar flankiert, ausschließlich an den 30S-Kopf liefert eine solche Wechselwirkung. Die durch die Kopfrotation erzeugten Kräfte könnten somit die Basenpaarung in helikalen Elementen der mRNA beim Eintritt in den stromabwärts gelegenen Tunnel destabilisieren.
(A) Der Eintritt in den Downstream-mRNA-Eintrittstunnel ist von den Proteinen uS3, uS4 und uS5 umgeben. Die Positionen +14 bis +21 berühren ein positiv geladenes Pflaster auf der Oberfläche des Proteins uS3 im 30S-Kopf (Abb. S17). (B) Pfad der Downstream-mRNA und (C) 90° gedrehte Ansicht. (D) Andocken an den 30S-Körper der klassischen Struktur (17) (grau) zeigt, dass die Rotation des Kopfes in der ap / ap-Zwischenstruktur die mRNA um ein Codon transloziert. A-Codon (gelb) und P-Codon (rot).
Im klassischen Zustand bilden C74 und C75 im CCA-Schwanz der P-Site-tRNA Basenpaare mit G2252 bzw. G2251 in der P-Schleife (H80) der 23S-rRNA, während C75 der A-Site-tRNA mit G2553 in der A-Schleife (H92) paart (18, 25, 26). Diese Wechselwirkungen positionieren die Peptidyl- und Aminoacylreste für die Peptidyltransferase-Reaktion (27), die eine deacylierte tRNA in der P-Stelle und eine Peptidyltrna in der A-Stelle hinterlässt. Ein kritischer Schritt bei der Translokation ist daher die anschließende Bewegung des Peptidyl-CCA-Endes von der A-Schleife zur P-Schleife. Die Struktur des Translokations-Intermediats zeigt einen chimären Zustand, der sich von den zuvor beschriebenen unterscheidet (Abb. S18), in dem das Akzeptorende der Peptidyl-tRNA gleichzeitig mit den A- und P-Schleifen interagiert (Fig 4). In diesem Zustand bleibt die Basenpaarung von C75 mit G2553 der A-Schleife erhalten, während die Bewegung seines Akzeptorstamms in eine Position nahe der der klassischen P-Site-tRNA es G2252 und G2253 in einer neu angeordneten P-Schleife ermöglicht, das tRNA-Rückgrat an den Positionen 72 und 70 zu kontaktieren (Abb. 4B). Somit ist das Ende des Akzeptorstamms der ap / ap-tRNA an der P-Schleife verankert, was die Übertragung seiner benachbarten C74- und C75-Reste von der A-Schleife auf die P-Schleife erleichtert. A76 der ap / Ap-tRNA ist ähnlich orientiert wie bei tRNA, die im klassischen P / P-Zustand (17) gebunden ist, wobei ihre N-Acetyl-Valin-Peptidyl-Einheit am Eingang des Peptid-Austrittstunnels positioniert ist, während C74 und C75 ihre Wechselwirkungen mit der A-Schleife der 23S-rRNA beibehalten (Abb. 4, S19).
Während der Translokation bewegt sich das 3′-Akzeptorende der Peptidyl-tRNA vom (A) klassischen A / A-Zustand in den (B) intermediären Ap / Ap-Zustand in den (C) klassischen P / P-Zustand, was durch Konformationsänderungen in den A- und P-Schleifen erleichtert wird.
Die ap/ap-tRNA kann Zwischenzuständen entsprechen, die kinetisch charakterisiert wurden. Fluoreszenz-Quenching-kinetische Studien identifizierten ein EF-G-abhängiges Intermediat (INT), bei dem sich das Peptidyl-tRNA-Ende von der A-Stelle in Richtung der P-Stelle bewegt, aber nur teilweise reaktiv mit dem Aminoacyl-tRNA-Mimik-Puromycin bleibt, was darauf hindeutet, dass sein CCA-Ende nicht vollständig in der P-Stelle untergebracht ist (28). Kinetische Studien, in denen eine Sonde direkt an das Peptidyl-tRNA-CCA-Ende gebunden wurde, identifizierten EF-G-abhängige Translokationszwischenprodukte, bei denen sich das Akzeptorende der Peptidyl-tRNA in Richtung der P-Stelle bewegt, aber Puromycin-unreaktiv bleibt (29). Die Eigenschaften dieser Zwischenprodukte sind mit dem hier beobachteten eingeschlossenen ap/ap-Zustand kompatibel. Die Struktur dieses eingeschlossenen Translokations-Intermediats beginnt zu beschreiben, wie sich tRNA zwischen den ribosomalen A- und P-Stellen bewegt. Die tRNA-Bindungsstellen selbst sind dynamisch und bilden gleichzeitige Kontakte zwischen der A-tRNA und Elementen sowohl der A- als auch der P-Stelle, ähnlich dem Passieren des Staffelstabs in einem Staffellauf (30). Dies gilt sowohl für die 30ER- als auch für die 50ER-Untereinheiten. In der 30S-Untereinheit setzt die Umlagerung der 966-Schleife der 16S-rRNA G966 von der P-Site-ASL frei, um die A-Site-ASL zu kontaktieren, wenn sie sich in die 30S-P-Site bewegt (Abb. 2E, F). In der 50S-Untereinheit ordnen sich die A- und P-Schleifen der 23S-rRNA neu an, damit beide Schleifen das 3′-Akzeptorende der A-Site-tRNA kontaktieren können, wenn sie ihren Übergang in die 50S-P-Site beginnt (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die strukturelle Dynamik der ribosomalen RNA eine aktive Rolle im Mechanismus der Translokation spielt.