In den 1970er Jahren wurde die meiste Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer stationären Phase mit festem Träger (auch Säule genannt) durchgeführt, die unmodifizierte Kieselsäure- oder Aluminiumoxidharze enthielt. Diese Art von Technik wird jetzt als Normalphasenchromatographie bezeichnet. Da die stationäre Phase bei dieser Technik hydrophil ist, weisen Moleküle mit hydrophilen Eigenschaften, die in der mobilen Phase enthalten sind, eine hohe Affinität für die stationäre Phase auf und adsorbieren daher an der Säulenpackung. Hydrophobe Moleküle erfahren eine geringere Affinität zur Säulenpackung und werden zuerst eluiert und nachgewiesen. Die Elution der an der Säulenpackung adsorbierten hydrophilen Moleküle erfordert die Verwendung von hydrophileren oder polareren Lösungsmitteln in der mobilen Phase, um die Verteilung der Partikel in der stationären Phase in Richtung der mobilen Phase zu verschieben. Die Umkehrphasenchromatographie ist eine Technik, bei der Alkylketten kovalent an die Partikel der stationären Phase gebunden werden, um eine hydrophobe stationäre Phase zu erzeugen, die eine stärkere Affinität zu hydrophoben oder weniger polaren Verbindungen aufweist. Die Verwendung einer hydrophoben stationären Phase ist im Wesentlichen das Gegenteil der Normalphasenchromatographie, da die Polarität der mobilen und stationären Phase invertiert wurde – daher der Begriff Reversed-Phase-Chromatographie. Bei der Reversed-Phase-Chromatographie wird eine polare (wässrige) mobile Phase eingesetzt. Infolgedessen neigen hydrophobe Moleküle in der polaren mobilen Phase dazu, an die hydrophobe stationäre Phase zu adsorbieren, und hydrophile Moleküle in der mobilen Phase passieren die Säule und werden zuerst eluiert. Hydrophobe Moleküle können aus der Säule eluiert werden, indem die Polarität der mobilen Phase unter Verwendung eines organischen (unpolaren) Lösungsmittels verringert wird, wodurch hydrophobe Wechselwirkungen verringert werden. Je hydrophober das Molekül ist, desto stärker bindet es an die stationäre Phase und desto höher ist die Konzentration an organischem Lösungsmittel, die zum Eluieren des Moleküls erforderlich ist.Viele der mathematischen und experimentellen Überlegungen, die in anderen chromatographischen Methoden verwendet werden, gelten auch für RPC (zum Beispiel ist die Trennauflösung von der Länge der Säule abhängig). Es kann zur Trennung einer Vielzahl von Molekülen verwendet werden. Es wird normalerweise nicht zur Trennung von Proteinen verwendet, da die in RPC verwendeten organischen Lösungsmittel viele Proteine denaturieren können. Aus diesem Grund wird die Normalphasenchromatographie häufiger zur Trennung von Proteinen verwendet. Die Denaturierung von Proteinen kann jedoch bei der späteren Analyse der aus der Chromatographie erhaltenen Proben tatsächlich von Vorteil sein. Wird an den analysierten Proteinen ein enzymatischer Aufschluss mit Trypsin durchgeführt, eignet sich hierfür eher linearisiertes Protein. Daher kann die Denaturierung von Proteinen mit geeigneten Lösungsmitteln, die die Entfaltung der Proteine bewirken, tatsächlich beabsichtigt werden, bevor die fraktionierte Probe massenspektrometrisch entnommen wird.
Heute ist RPC eine häufig verwendete Analysetechnik. Für den Einsatz in RPC stehen verschiedene stationäre Phasen zur Verfügung, die eine große Flexibilität bei der Entwicklung von Trennmethoden ermöglichen.
Stationäre Phasen auf Kieselsäurebasis
Jede inerte polare Substanz, die eine ausreichende Packung erreicht, kann für die Umkehrphasenchromatographie verwendet werden. Die beliebteste Säule ist eine Octadecyl-Kohlenstoffkette (C18) -gebundene Kieselsäure (USP-Klassifizierung L1). Es folgen C8-gebundene Kieselsäure (L7), reine Kieselsäure (L3), cyan-gebundene Kieselsäure (L10) und phenyl-gebundene Kieselsäure (L11). Beachten Sie, dass C18, C8 und Phenyl dedizierte Reversed-Phase-Harze sind, während Cyano-Säulen je nach Analyt- und Mobilphasenbedingungen in einem Reversed-Phase-Modus verwendet werden können. Nicht alle C18-Säulen haben identische Retentionseigenschaften. Die Oberflächenfunktionalisierung von Siliciumdioxid kann in einer monomeren oder polymeren Reaktion mit verschiedenen kurzkettigen Organosilanen durchgeführt werden, die in einem zweiten Schritt zur Abdeckung verbleibender Silanolgruppen eingesetzt werden (End-Capping). Während der gesamte Retentionsmechanismus gleich bleibt, führen subtile Unterschiede in der Oberflächenchemie verschiedener stationärer Phasen zu Änderungen der Selektivität.
Moderne Säulen haben eine andere Polarität. PFP steht für Pentafluorphenyl. CN ist Cyan. NH2 ist Amino. ODS ist Octadecyl oder C18. ODCN ist eine Mischmodesäule, die aus C18 und Nitril besteht. SCX ist ein starker kationischer Austausch (wird zur Trennung organischer Amine verwendet). SAX ist ein starker anionischer Austausch (wird zur Trennung von Carbonsäureverbindungen verwendet).